限制性内切酶小知识VIP免费

限制性核酸内切酶制作人：***日期：*****简介限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease):识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。[别名]Endodeoxyribonuclease[酶反应]限制性内切酶能分裂DNA分子在一限定数目的专一部位上。它能识别外源DNA并将其降解。[单位定义]在指明pH与37℃，在0.05mL反应混合物中，1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。定义和命名DNA限制性内切酶：生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)。限制性核酸内切酶的命名；一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株(品系)。例如，从BacillusamyloliquefaciensH中提取的限制性内切酶称为BamH，在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号，如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboI等。特征和种类1．限制与修饰现象早在50年代初，有许多学者发现了限制与修饰现象，当时称作寄主控制的专一性（hostcontrolledspecificity）。l噬菌体表现的现象便具有代表性和普遍性，其在不同宿主中的转染频率可说明这一问题（表2-1）。l在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时会受到限制。E.coli菌株λ噬菌体感染率lKlBlCE.coliK110-410-4E.coliB10-4110-4E.coliC111说明K和B菌株中存在一种限制系统，可排除外来的DNA。10-4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果，此时限制系统还未起作用。而在C菌株不能限制来自K和B菌株的DNA。限制作用实际就是限制酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用，可使腺嘌呤A成为N6甲基-腺膘呤，胞嘧啶C成为5'甲基胞嘧啶。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。2.限制与修饰系统的种类根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制与修饰系统主要分成三大类。表2-1是各种限制与修饰系统的比较。Ⅱ型（typeⅡ）限制与修饰系统所占的比例最大，达93%。Ⅱ型酶相对来说最简单，它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割DNA，产生带3'-羟基和5'-磷酸基团的DNA产物，需Mg2+的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需SAM。识别序列主要为4-6bp，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列，切割位置因酶而异，有些是隔开的。Ⅱs型（typeⅡs）限制与修饰系统，占5%，与Ⅱ型具有相似的辅因子要求，但识别位点是非对称，也是非间断的，长度为4-7bp，切割位点可能在识别位点一侧的20bp范围内。Ⅱ型限制酶一般是同源二聚体（homodimer），由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成，每个亚单位作用在DNA链的两个互补位点上。修饰酶是单体，修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成，分别作用于其中一条链，但甲基化的碱基在两条链上是不同的。在Ⅱ型限制酶中还有一类特殊的类型，该酶只切割双链DNA中的一条链，造成一个切口，这类限制酶也称切口酶（nickingenzyme），如N.BstNBI。Ⅰ型（typeⅠ）限制与修饰系统的种类很少，只占1%，能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。如EcoK和EcoB。其限制酶和甲基化酶（即R亚基和M亚基）各作为一个亚基存在于酶分子中，另外还有负责识别DNA序列的S亚基，分别由hsdR、hsdM和hsdS基因编码，属于同一操纵子（转录单位）。EcoK编码基因的结构为R2M2S。EcoB编码基因的结构为R2M4S2。EcoB酶的识别位点如下，其中两条链中的A为甲基化位点，N表示任意碱基。TGA*（N）8TGCTEcoK酶的识别位点如下，其中两条链中的A为可能的甲基化位点。AA°C（N）6GTGC但是EcoB酶和EcoK酶的切割位点在识别位点1000bp以外，且无特异性。Ⅲ型（typeⅢ）限制与修饰系统的种类更少，所占比例不到1%，也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序。它在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则是...