马玉超马玉超北京林业大学生物科学与技术学院北京林业大学生物科学与技术学院办公地点：生物楼办公地点：生物楼117117；电话：；电话：6233601662336016；；Email:myc0307@gmail.comEmail:myc0307@gmail.com现代微生物学实验技术现代微生物学实验技术实验内容实验内容♣16SrRNA基因的PCR扩增、电泳及系统发育分析♣染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列♣大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导表达♣利用SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性♣绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取16SrRNA基因的PCR扩增、电泳及系统发育分析窦桂铭实验目的1.掌握PCR的原理，增强对PCR重要性的认识；2.掌握电泳技术及系统发育分析的方法，为将来课题研究奠定基础。PCR（PolymeraseChainReaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序PCR（PolymeraseChainReaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序设想设想——实现实现——改进与完善改进与完善72℃72℃9494℃55℃55℃PCRPCR循环循环PCR技术的反应原理PCR技术的反应原理PCR技术的反应原理PCR技术的反应原理DNA或RNA模板DNA或RNA模板5´5´5´5´待扩增DNA区域待扩增DNA区域3´3´94℃5min94℃5min5´5´5´5´55℃55℃退火退火5´5´5´5´聚合聚合3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´循环25-30次循环25-30次变性变性70℃70℃DNA引物DNA引物DNA聚合酶DNA聚合酶dNTPsdNTPsMg2+（缓冲液）Mg2+（缓冲液）12①5´5´5´5´目的基因目的基因变性变性加热加热5´5´5´5´引物引物退火退火5´5´5´5´底物底物延伸延伸5´5´5´5´5´5´加热加热变性变性5´5´退火引物退火引物2230个循环：230目标DNA片段达106-10730个循环：230目标DNA片段达106-107变性－退火－延伸5´5´5´5´245´5´5´5´5´5´5´5´5´5´延伸延伸5´5´5´5´5´5´5´5´5´5´一个标准的PCR过程核酸的凝胶电泳基本原理当一种分子被放置在电场中时，它们就会以一定的速度移向适当的电极。这种电泳分子在电场作用下的迁移速度——电泳的迁移率。迁移率的影响因素：电场长度、电泳分子的电荷数量、电泳分子与支持介质的摩擦系数等。在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团是呈离子化状态的——叫做多聚阴离子。方向：负→正种类：水平垂直琼脂糖聚丙烯酰胺普通DNARNA小分子量核酸二、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖：线性多糖聚合物、从红色海藻产物琼脂中提取而来。加热→凝固：网孔状的电泳介质，密度由琼脂糖的浓度决定。琼脂糖凝胶分辨DNA片段的能力琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围:0.2-50kb凝胶浓度线形DNA的最佳分辨范围（bp）0.5%1,000～30,0000.7%800～12,0001.0%500～10,0001.2%400～7,0001.5%200～3,0002.0%50～2,000琼脂糖DNA分子在电泳过程中迁移的距离受以下几个因素的影响：核酸分子量的大小分子状态物理电压缓冲液温度电泳指示剂：溴芬兰，距边缘1cm左右停止电泳。电泳染色剂：溴化乙锭(ethidiumbromide,简称EtBr)，扁平染料，嵌到DNA或RNA分子的碱基之间，借助紫外灯观察。DNAMarker1.2kb800bp操作步骤成分贮液浓度使用量(20μl体系)水——14μl10×GCBufferMg2+Plus2μldNTPs2.5mmol0.5μl16Sp110pmol/μl1μl16Sp210pmol/μl1μl基因组DNA100μg/ml1μlTaq酶5U/μl0.5μl循环次数反应条件195℃（10min）3094℃；30s58℃；1min72℃；1min30s172℃；10min172(10min)℃操作步骤(1)称取琼脂糖，用适当的电泳缓冲液(常用1×TAE)配成所需浓度的胶；10×TAE缓冲液配制：0.4MTris-乙酸；0.02MEDTA，pH8.0(2)置微波炉中加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解；(3)按照每20ml胶加入1µlGoldview/20ml；(4)凝胶溶液冷却至50℃左右，倒入电泳胶盘，避免出现气泡，室温放置，至胶凝固；(5)小心拔出梳子，将胶盘放到有1×TAE缓冲液的水平电泳槽中；(6)样品中加入1/5体积的6×loadingbuffer，混匀，用移液器小心加到点样孔中，以稳定电压(4-5V/cm)电泳；6×加样指示剂配方:0.25%溴酚蓝;40%(W/V)蔗糖水溶液；(7)取出凝胶，紫外灯下观察电泳结果，如有必要，拍照记录。琼脂糖凝胶电泳：RibosomalRNASequences核糖体RNA序列与进化（1）...
