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基因工程背景：家蚕能够吐出蚕丝为人类利用。但繁殖慢，产量低。能否让大肠杆菌也能吐蚕丝呢？大肠杆菌繁殖很快，但不会产丝。•用人工方法，把甲生物的某个基因提取出来，在体外进行切割、拼接和重组，然后将其导入乙生物的细胞内进行大量复制，并进行表达，从而定向地改变乙生物的遗传性状，或获得人类所需要的基因产物（蛋白质、多肽、酶）。剪切拼接导入甲生物取出所需基因生物新类型表达新的生物产品乙生物基因的大小以纳米计算，要对它进行剪切、拼接等操作，没有非常精细的工具是不行的。进行基因操作最少需要以下三种工具：１、基因的手术刀２、基因的针线3、基因的运输工具主要在原核生物中。特异性。即一种限制性内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将DNA分子切断（使连接脱氧核苷酸的磷酸二酯键断裂）。已发现数千种种类:来源:特点:１、基因的剪刀──限制性核酸内切酶例如：大肠杆菌的一种限制酶能识别例如：大肠杆菌的一种限制酶能识别GAATTCGAATTC序列，并在序列，并在GG和和AA之间切开。之间切开。限制酶限制酶GAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAG5′5′5′5′3′3′3′3′粘性末端粘性末端限制性限制性内切酶内切酶CTTAACTTAAGG5′5′3′3′AATTCAATTCGG3′3′5′5′被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们两个之间正好反向互补配对，这样的切口叫粘性末端。被同一种限制酶切断的几个DNA就具有相同的粘性末端，能够通过互补进行配对。TGCATGCAACGTACGT5′5′3′3′3′3′5′5′不同的限制酶所形成的粘性末端不同ACGACGTT5′5′3′3′GCAGCATT3′3′5′5′另一种另一种限制酶限制酶２、基因的针线作用：作用：将粘性末端碱基互补的两个DNA片段连接起来，使之成为一个完整的DNA分子（使两个DNA片段通过磷酸二酯键连接成一个DNA分子）。──DNA连接酶CTTAACTTAAGGAATTCAATTCGG连接酶连接酶3、基因的运输工具基因载体的条件：基因载体的条件：•能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。•具有多个限制酶切点（每种限制酶切点只有一个），以便与外源基因连接。•具有标记基因，便于进行筛选。──载体要把甲生物取出的基因送到乙生物的细胞中去，需要运输基因的载体。最常用的基因载体是细菌细胞质的最常用的基因载体是细菌细胞质的质粒质粒（核区）质粒（细胞质DNA）大肠杆菌大肠杆菌质粒质粒能能自主复制自主复制的的双链环状双链环状DNADNA分子，分子，存在于细菌存在于细菌核区核区以外，以外，带有少量基因，其中带有少量基因，其中常含常含有有抗生素抗性基因（如抗生素抗性基因（如四环素的抗性基因）四环素的抗性基因），使细菌有抗药性，一个细菌中有，使细菌有抗药性，一个细菌中有多个质粒。多个质粒。最常用的基因载体是细菌细胞质的最常用的基因载体是细菌细胞质的质粒质粒（核区）质粒（细胞质DNA）大肠杆菌大肠杆菌质粒与宿主细胞的关系：质粒与宿主细胞的关系：11、质粒的存在对宿主细胞、质粒的存在对宿主细胞无影响无影响。。22、质粒的复制、质粒的复制只能只能在宿主细胞内完成。在宿主细胞内完成。抗生素抗性基因（标记基因）（细胞质DNA）（核区）质粒(细胞质DNA)大肠杆菌大肠杆菌控制质粒DNA转移的基因4、筛选含有目的基因的受体细胞1、获得目的基因2、形成重组DNA分子3、将重组DNA分子导入受体细胞5、目的基因的表达第二节基因工程的原理和技术第二节基因工程的原理和技术基因工程的基本操作步驟基因工程的基本操作步驟①逆转录法：信使RNA逆转录酶DNA单链合成DNA双链(基因)②直接合成法：组成蛋白质的氨基酸序列推测信使RNA核苷酸序列推测基因单核苷酸序列合成基因双链１、获得目的基因（1）化学合成法（目的基因的序列巳知）人工合成人工合成((基因比较小基因比较小))DNADNA合成仪合成仪（2）用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因1234522557294时间（min）温度（℃）PCR反应适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍（3）从基因文库中分离：目的基因的脱氧核苷酸序列是未知的，可以从基因文库中找到目的基因（酶切）...