RNA干扰抑制CD147表达对人胃癌细胞SGC7901增殖、侵袭和顺铂敏感性的影响2010.5.18王书奎王书奎MD,PhDMD,PhD南京医科大学附属南京第一医院报告内容研究背景研究目标实验方法与结果实验结论一、研究背景胃癌概况胃癌最常见的恶性肿瘤之一，恶性肿瘤致死占第二位。其恶性程度较高，转移扩散严重，多数患者就诊时已属中晚期，因而死亡率较高。MMP简介肿瘤的侵袭和转移是一个复杂的过程，其中细胞外基质和基底膜的降解是肿瘤转移过程中的重要步骤。这与细胞外基质金属蛋白酶（extracellularmatrixmetalloproteinase，MMP）的参与密不可分。MMP是一个锌离子依赖的蛋白酶家族，目前已发现26种。MMP的主要功能是降解细胞外基质。肿瘤细胞利用MMP的基质降解能力迁移到其他部位。在肿瘤与间质交界处，MMP往往高表达。20世纪80年代，Biswas实验室从人肺癌细胞株LX-1的细胞膜上分离得到了一种58kDa的糖蛋白，具有刺激成纤维细胞合成MMP-1的功能，将其命名为肿瘤胶原酶刺激因子（tumorcollagenasestimulatingfactor，TCSF）。进一步研究表明TCSF不仅能刺激MMP-1的产生，还能刺激MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-11等的产生，因此将其重命名为细胞外基质金属酶诱导因子（extracellularmatrixmetalloproteinaseinducer，EMMPRIN)。第六届人类白细胞分化抗原协作组会议将EMMPRIN命名为CD147。CD147的结构CD147属单次跨膜糖蛋白，胞外段中的4个半胱氨酸残基形成2个二硫键，构成2个典型的半球形Ig结构域。细胞内的CD147存在低糖基化（lowglycosylatedCD147，LG）和高糖基化（highglycosylatedCD147，HG）形式，分子量分别是32~44kDa、45~65kDa。只有HG形式能刺激MMP的产生。CD147的功能CD147是一种广泛表达于细胞表面，在体内分布广泛，参与精子发生、胚胎发育、肿瘤的侵袭和转移、炎症反应、病毒感染等多种生理和病理过程，是一个多功能的分子。免疫组化实验证实CD147在多种恶性肿瘤中高表达，包括膀胱癌、皮肤癌、肺癌、乳腺癌、淋巴癌和胰腺癌等。并且肿瘤的恶性程度越高，CD147的表达水平也越高。CD147在肿瘤发生发展中的作用1.促进肿瘤的侵袭和转移CD147就是通过刺激成纤维细胞及肿瘤细胞本身产生多种MMP来降解基底膜和细胞外基质，从而促进肿瘤的浸润和转移的。2.诱导肿瘤血管生成血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）是很多情况下血管生成过程的主要调节因子，包括肿瘤形成过程。CD147可以诱导VEGF的表达。3.促进肿瘤细胞多药耐药在多种多药耐药的肿瘤细胞中都观察到CD147的高表达。CD147可激活PI3K/AKT细胞存活信号通路。在大多数恶性肿瘤细胞中此通路均被激活。胃癌中CD147的表达日本Toyama大学的ZhengHC等研究表明：在正常胃黏膜发展为增生性或化生性胃黏膜，最后发展为胃癌的过程中，CD147的表达量是逐渐增加的，并且CD147的表达与肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移以及MMP-2、MMP-9和VEGF的表达呈正相关。胃癌组织中CD147的表达CD147在胃癌组织中高表达二.研究目标本实验旨在运用RNA干扰技术抑制胃癌细胞株SGC7901中CD147基因的表达，研究该基因沉默后对肿瘤细胞生长、侵袭能力及化疗药物敏感性的影响，探讨CD147在胃癌中的作用。三、研究方法及结果CD147shRNA真核表达载体的构建与鉴定↓转染SGC7901细胞，筛选稳定表达干扰载体的SGC7901细胞株↓MTT法检测SGC7901细胞增殖水平的变化↓明胶酶谱法检测SGC7901细胞MMP-2、MMP-9分泌的变化↓SGC7901细胞体外侵袭力测定↓MTT检测SGC7901细胞顺铂敏感性的变化技术路线技术路线胃癌细胞株SGC7901源自一位56岁女性胃腺癌患者的淋巴结转移瘤。研究表明其侵袭能力强，恶性程度高。我们前期研究表明，该细胞表面CD147是高表达的。shRNA（shorthairpinRNA）表达载体的构建pSilencer3.1-H1neoshRNA模板的设计示意图干扰靶序列的选择参考陈翔等的报道，选取CD147mRNA370-390和808-828作为靶序列，相应的shRNA分别命名为shRNA1和shRNA2。另外，设计一个阴性对照shRNA-control。RNAi靶序列在CD147mRNA上的位置•1AGCGGTTGGAGGTTGTAGGACCGGCGAGGAATAGGAATCATGGCGGCTGC•51GCTGTTCGTGCTGCTGGGATTCGCGCTGCTGGGCACCCACGGAGCCTCCG•101G...
