Brdu-细胞增殖检测实验

Brdu 检测细胞增殖实验实验操作:1． 铺细胞，每个 3.5cm dish 10 万个，在 37℃、5％CO2孵箱中培育 72h（细胞密度至 50-60%左右）.2． Brdu(5—溴-2′—脱氧尿苷）加入培育细胞中，1mg/ml，标记 48h。(量：Brdu 以铺满整个 dish 底面为准。)3． 固定:PBS 洗细胞爬片 3 次,每次 5min,在摇床上晃动清洗，4％PFA 固定 30min。4． 变性：将固定好的细胞爬片用 PBS 洗 3 次,每次 5min，2mol/L 的 HCl 在 37℃条件下变性 5min，可放置于 37℃恒温孵箱，应用封口膜把培育皿封好。（120r/m）5． 中和：0.1mol/L 的硼酸钠（PH8。3）中和 10min，PBS 洗 3 次，每次 5min。（50r/m）6． 加入 1ml 的 0。2%TritonX-100，10min.7． 吸出 TritonX—100，用 PBS 洗 3 次，每次 5min。8． 加入 1ml 3%的 BSA 封闭,室温 1h，可在摇床上晃动。9． 吸出 BSA，用 PBS 洗 3 次，每次 5min.10．加一抗（尿嘧啶脱氧核苷 Brdu(鼠单抗)1:200），用 1%BSA 稀释，4 度过夜.11．将孵好一抗的细胞爬片用 PBS 洗 3 次，每次 10min。12．加二抗(羊抗鼠 IgG/Alexa Fluor 594 1: 100），用 1%BSA 稀释，避光室温孵育 1h。（60 r/min）13．将孵好二抗的细胞爬片用 PBS 洗 3 次，每次 10min。14．加 DAPI 染细胞核,储存浓度为 1mg/ml，应将 DAPI 完全混匀，可用手弹几下，一般稀释比例为 1：1000（用 PBS 稀释），避光室温反应 10min。15．将 DAPI 染好的细胞爬片用 PBS 洗 3 次，每次 10min。16．中性树胶封片，荧光显微镜观察,200×镜下取 5 个视野，计数 Brdu 阳性细胞和蓝染的细胞核数目,然后进行统计分析。试剂配制：a。 Brdu 的溶解：室温下，将 250mg 粉末溶于 2.5ml 的 DMSO 中，储存浓度为 100mg/ml分装，每管 120ul，-20℃保存。b. 2 mol/L HCl：取 8。333mL 12 mol/L HCl 的浓 HCl，加入 DDW 定容至 50 mL。c。 0.1 mol/L 硼酸钠：称量 1。907g 硼砂（Na2B4·10H2O 381。36 g/mol）,加入 DDW 定容至 50 mL,调 PH=8。3。d。 0.2% Triton X-100：有 0.5%的 Triton-100（2。5 mL 原液溶解于 47。5 mL 的 PBS 中），用 PBS 稀释至 0.2%。e. 3% BSA：称量 1。5g BSA，溶解于 50 mL 的 PBS 中.f。 1％ BSA:用 PBS 稀释 3%BSA 至 1％.g. 4％FPS：4%多聚甲醛。我是用 DDW 配制的，后来我发现很...