奶牛乳腺上皮细胞三维培养的形态观察王秀美1考桂兰1高爱武2*侯先志1高民3（1.内蒙古农业大学动物科学与医学学院，呼和浩特010018；2.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，呼和浩特010018；3.内蒙古农牧业科学院，呼和浩特010010）摘要：本研究利用原代培养后纯化的奶牛乳腺上皮细胞，以Matrigel为基质胶原，进行奶牛乳腺上皮细胞的三维培养，细胞接种浓度分别为1×104细胞/ml、1×105细胞/ml和1×106细胞/ml。经过16天培养后，用DAPI对细胞染色，利用荧光显微镜观察细胞生长状况。结果表明，当细胞接种浓度为1×104—105细胞/ml时，细胞形成了团块状结构，出现了类似腔状的腺泡形态。关键词：奶牛乳腺上皮细胞；三维培养；基质1引言乳腺组织的上皮细胞能以血液中各种营养物质为原料，合成并分泌乳汁。建立可表达泌乳蛋白的乳腺上皮细胞系，能够极大方便乳腺上皮细胞中乳成分基因表达及调控的研究，为进一步研究各种营养因素对泌乳过程的影响奠定基础。乳腺上皮细胞在体内存在于三维环境中，细胞外广泛分布着胞外基质（extracellularmatrix，ECM），它们主要由细胞分泌的蛋白和多糖构成。胞外基质对细胞形态、生长、凋亡和代谢功能起重要的调控作用，如β-酪蛋白的基因转录就受到激素及细胞与基质相互作用的共同协调[1]。乳腺上皮细胞在体内基质环境中，形成中空腔状的腺泡结构。常规的体外细胞培养都是单层培养（二维培养），形成贴壁生长的单层细胞形态。研究证明，二维生长的人乳腺上皮细胞不能形成腺泡结构，缺失了对生长因子和催乳激素的响应，并且也检测不到分化所产生的蛋白质，如乳清蛋白和β-酪蛋白。但当它们生长于胞外基质成分中时，就能形成腺泡结构，并对激素信号产生响应[2]。类似的关于胞外基质信号对上皮细胞生理和生化的影响在其它组织的研究中也得到了证实[3,4,5]。此外，单层培养的牛乳腺上皮细胞也不能长时间维持乳蛋白的合成与分泌[6,7,8]。上述结果说明，常规的二维细胞培养不能模拟体内乳腺上皮细胞的腺体结构，因此不能提供理想的体外模型以研究细胞的代谢功能[9]。模拟细胞体内生存状态的三维细胞培养技术成为今后细胞培养技术发展的必然趋势。本试验以奶牛乳腺上皮细胞为研究对象，对传代培养的奶牛乳腺上皮细胞进行三维培养，并比较二维和三维培养的奶牛乳腺上皮细胞的形态学差异，旨在为后续的乳腺上皮细胞三维培养提供合理依据。2材料与方法2.1试验材料2.1.1乳腺组织选取健康的5-7岁泌乳中国黑白花奶牛的乳腺组织。2.1.2试剂及仪器培养基分别为DMEM/F12（高糖型，Gibco公司）和乳腺上皮专用培养基（Sciencell公司）；根据试验需要，向其中添加胰岛素转铁蛋白（ITS,），表皮生长因子（EGF）、氢化可的松（Hydrocortisone）、标准胎牛血清（FBS，highcolone公司）和Matrigel（Gibco公司），组成及浓度如表1所示。Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶（Trypsin）、EDTA为Chembasebio公司生产。使用时，将Ⅱ型胶原酶用基础培养基溶解，制成终浓度为0.5%的溶液，备用。用于消化细胞的胰蛋白酶溶液和EDTA溶液浓度分别为0.25%和0.02%。细胞培养用其余试剂购自国产公司。除Matrigel外，所有试剂均采用过滤方式除菌，滤膜孔径为0.22μm。细胞染色用DAPI为Sigma公司产品，染液按照说明书进行配制，备用。试验所用其它仪器有荧光倒置相差显微镜（Motic公司）、CO2培养箱（香港力康）、超净工作（江苏苏净）及离心机等。2.2试验方法2.2.1乳腺组织的取样于呼和浩特市北亚清真屠宰场选择健康的5-7岁泌乳奶牛，屠宰后立即选取乳腺组织，表1用于细胞培养的培养基配方Table1Themediumcompositionforcellculture培养基组成生长培养基终止培养基分析培养基DMEM/F12基础培养基860ml900ml—上皮细胞专用培养基——98ml胎牛血清（FBS）100ml100ml—(终浓度：10%l)(终浓度：10%l)生长激素（EGF）10ml——(贮液浓度：1μg/ml）(终浓度：10ng/ml)胰岛素转铁蛋白（ITS）10ml——(贮液浓度：500μg/ml)(Insulin终浓度：5μg/ml)氢化可的松（He）10ml——(贮液浓度：1mg/ml)(终浓度：10μg/ml)双抗（Pen/Strep）10ml——(贮液浓度：10000unit/ml)(终浓度：100unit/ml)Matrigel——2ml(终浓度：2%)...
