第二章 基因工程的理论基础与基本技术VIP专享VIP免费

第二章基因工程的理论基础与基本技术第二章基因工程的理论基础与基本技术第一节基因工程的理论基础第一节基因工程的理论基础（一）原核生物的基因结构特点（一）原核生物的基因结构特点1.操纵子结构操纵子（Operon），由几个功能相关的结构基由几个功能相关的结构基因成簇排列而组成的一个基因表达的协同单位因成簇排列而组成的一个基因表达的协同单位（（coordinatedunitecoordinatedunite），称为操纵子。），称为操纵子。一基因结构特点一基因结构特点调节基因启动子操纵基因结调节基因启动子操纵基因结构基因构基因大肠杆菌乳糖操纵子色氨酸操纵子2.原核细胞mRNA的特征（1）半衰期短（2）多顺反子形式（3）存在SD序列原核生物中起始密码子AUG上游7～12个核苷酸序列因其与16SrRNA3’末端反向互补而被认为在核糖体-mRNA的结合过程中起作用。（4）起始密码子常为AUG（有时GUG，甚至UUG）。3.原核细胞基因的终止子根据对细菌和噬菌体DNA模板上的终止信号的分析，发现它们具有共同的结构特征：①终止点上游存在一个富含GC碱基的二重对称区，由这段DNA转录产生的RNA容易形成发卡式结构；②在终止点前面有一段由4～8个A组成的序列，因此转录产物的3’端为寡聚U。UUUUUUUUUUUURNA（二）真核生物基因的结构特点（二）真核生物基因的结构特点1.真核生物基因的不连续性断裂基因（interruptedgene）内含子是一个基因中非编码DNA片段，它分开相邻的外显子。外显子是一个基因中编码蛋白序列。严格地说,外显子是指保留在初级mRNA中不被剪切掉的区域,包括5’非翻译区(5’UTR)、编码序列和3’非翻译区(3’UTR)。外显子-内含子连接区是指外显子和内含子的交界，又称边界序列。GT-AG法则序列分析表明，几乎每个内含子5’端起始的两个碱基都是GT，3’端最后两个碱基总是AG，由于这两个碱基的高度保守性和存在的广泛性，有人把它称为GT-AG法则，即：5’GT…AG3’。PS外显子SPL外显子L外显子2外显子3DNA50b2800bp161bp4500bp205bp327bp初始转录本：在唾腺中转录成熟mRNA：1663nt初始转录本：在肝中转录成熟mRNA：1773nt图18-57小鼠淀粉酶(amy)基因利用不同启动子产生两个不同的mRNA卫星DNA真核生物基因组中高度重复的DNA,有一些20～30bp的极短序列，且以数千个拷贝的串连方式排列，这种序列称为卫星DNA。2.卫星DNA在染色体DNA片段的氯化铯密度梯度离心中，由于浮力密度的不同，这种重复序列在主带DNA附近出现的卫星带，因此称之为卫星DNA。3.真核生物mRNA的特征（1）5’端的帽子结构几乎全部的真核mRNA端都具“帽子”结构。虽然真核生物的mRNA的转录以嘌呤核苷酸三磷酸（pppAG或pppG）领头，但在5’端的一个核苷酸总是7-甲基鸟核苷三磷酸（m7GpppAGpNp）。mRNA5’端的这种结构称为帽子（cap）。不同真核生物的mRNA具有不同的帽子。(1)(1)有助于有助于mRNAmRNA越过核膜，进入胞质；越过核膜，进入胞质；(2)(2)保护保护5′5′不被核酶降解；不被核酶降解；(3)(3)翻译时供翻译时供IFⅢIFⅢ（起始因子）和核糖体（起始因子）和核糖体识别，是翻译所必需的。识别，是翻译所必需的。（2）3’末端Poly（A）尾巴除了组蛋白以外，真核生物mRNA3’末端都有由40~200个A组成的Poly（A）尾巴。Poly(A)尾不是由DNA编码的，而是转录后的前体mRNA以ATP为前体，由RNA末端腺苷酸转移酶，即Ploy(A)聚合酶催化聚合到3’末端。Poly（A）尾巴在基因工程操作中的作用：A、用Poly（T）作为合成cDNA第一链的引物。B、用Poly（T）纯化柱从总RNA中分离mRNA寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。•是mRNA由细胞核进入细胞质所必需的形式；•它大大提高了mRNA在细胞质中的稳定性。mRNA刚从细胞核进入细胞质时，其多聚(A)尾巴一般比较长，随着mRNA在细胞质内逗留时间延长，多聚(A)逐渐变短消失，mRNA进入降解过程。•它可促进核糖体的有效循环。Poly（A）尾巴有三个方面的功能：寡聚（寡聚（dTdT））--纤维素柱层析法纤维素柱层析法常规方法常规方法RNA(RNA(高盐缓冲液高盐缓冲液))寡聚（寡聚（dTdT）纤维素柱）纤维素柱低盐溶液和蒸馏水低盐溶液和蒸馏水洗脱洗脱较高纯度的较高纯度的mRNAmRNA...