蛋白质理化性能与纯化VIP免费

第六节蛋白质的理化性质与分离纯化ThePhysicalandChemicalCharactersandSeparationandPurificationofProtein一、理化性质（一）蛋白质的两性电离性质蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。*蛋白质的等电点(isoelectricpoint,pI)当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。（二）蛋白质的胶体性质•蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万或更大，由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之内。•蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。•由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。*蛋白质胶体稳定的因素:颗粒表面电荷、水化膜+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜++++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉（三）很多因素可引起蛋白质的变性*蛋白质的变性(denaturation)：在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失；*变性后的蛋白质称为变性蛋白；•造成变性的因素•温度（热、冷）加热；•强酸、强碱；•尿素和盐酸胍的影响（破坏分子内部氢键、破坏疏水效应）；•表面活性剂的影响：如十二烷基硫酸钠（SDS）等•变性的本质——破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。食品方面；蛋白质制备；酶制剂保存等；此外,防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。应用举例复性(renaturation)若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性；类型：不可逆变性、可逆变性（可复性）。尿素、β-巯基乙醇去除尿素、β-巯基乙醇天然状态，有催化活性非折叠状态，无活性（四）蛋白质的沉淀作用•蛋白质沉淀在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而蛋白质从溶液中析出；•变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性；•蛋白质的凝固作用蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中；•蛋白质的沉淀分为可逆沉淀和不可逆沉淀。1、可逆沉淀•在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。•在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。•可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。盐析法：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠）使蛋白质沉淀析出的现象（水与离子的相互作用增加了蛋白质表面的疏水补丁的相互作用；同时瓦解了以电荷为基础的蛋白质分子之间的作用）。盐溶：低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，此现象叫盐溶。等电点沉淀法（脱去水化层、降低介电常数）。在低温下或缩短处理时间可防止或减缓变性。有机溶剂沉淀法2、不可逆沉淀•在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。•由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。•如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。（五）蛋白质在紫外光谱区有特征性吸收峰•大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。•这三种氨基酸的在280nm附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm附近显示强的吸收；•蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，可以对蛋白质进行定性鉴定和定量测定。（六）蛋白质的呈色反应可用于溶液蛋白质测定⒈蛋白质经水解后产生茚三酮反应蛋白质经...