蛋白样本制备蛋白样本制备与与WesternBlot主要内容主要内容一一蛋白样本制备的目的与重要性蛋白样本制备的目的与重要性二二蛋白样本制备的总体策略和原则蛋白样本制备的总体策略和原则三三案例分析案例分析——细胞总蛋白的提取细胞总蛋白的提取11细胞裂解液配方分析与技术要点细胞裂解液配方分析与技术要点22表面活性剂的选择表面活性剂的选择33蛋白酶抑制剂与其蛋白酶抑制剂与其””鸡尾酒鸡尾酒””44磷酸酶抑制剂磷酸酶抑制剂四四蛋白提取产品选择指南蛋白提取产品选择指南11核蛋白与转录因子核蛋白与转录因子EMSAEMSA分析分析22膜蛋白提取膜蛋白提取33多种蛋白的分级提取多种蛋白的分级提取五五蛋白定量方法的选择蛋白定量方法的选择六成功的WesternBlot1WB1WB原理与方法原理与方法2WB2WB的成功要素的成功要素33常见问题分析与解决方法常见问题分析与解决方法一一蛋白样本制备蛋白样本制备------成功蛋白分析的基础成功蛋白分析的基础11蛋白样本制备的目的蛋白样本制备的目的::后续应用于后续应用于::�activityassays�proteinmicroarrays�SDS-PAGE/IEF�immunoblotting(WesternBlotting)�ELISA�EMSA(gelshift)�two-dimensionalgelelectrophoresis(2D),�massspectrometry2蛋白样本制备的重要性:蛋白样本制备是蛋白试验的第一步,更是最重要的步骤!是决定试验成败的关键!但却往往是最容易被忽视的步骤!误解1:认为简单误解2:方法单一细胞内蛋白质的复杂性细胞内蛋白质的复杂性��种类多种类多::数千种数千种,,并且是混合物并且是混合物((与核酸多糖脂质小分子混一与核酸多糖脂质小分子混一起起))��分子大小分布范围宽分子大小分布范围宽::几百个至上万氨基酸几百个至上万氨基酸,,多数为多数为11万万----1515万道尔顿万道尔顿��含量不均含量不均::某种可能占总蛋白的某种可能占总蛋白的10%,10%,有些只占有些只占0.001%0.001%以以下下��性质多样性质多样::正电或负电荷正电或负电荷\\极性或非极性极性或非极性\\亲水或疏水亲水或疏水,,二级二级结构或空间结构形成大小形状残基分布等均不同的分子结构或空间结构形成大小形状残基分布等均不同的分子二二蛋白样本制备的原则蛋白样本制备的原则��方法应具备标准化方法应具备标准化具有重现性具有重现性可靠性和简便性可靠性和简便性��尽尽量抽提完全量抽提完全��应使所有蛋白全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋应使所有蛋白全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白）白）��防止发生蛋白的降解防止发生蛋白的降解聚集聚集沉淀沉淀变性变性��防止在抽提过程中发生化学修饰（如酶性或化学性降防止在抽提过程中发生化学修饰（如酶性或化学性降解等）解等）��如做如做2D2D则需去除高丰度蛋白则需去除高丰度蛋白或无关蛋白或无关蛋白��必要时去除样品中的核酸和某些干扰蛋白必要时去除样品中的核酸和某些干扰蛋白二二蛋白样本制备的策略蛋白样本制备的策略��制备蛋白的目的制备蛋白的目的活性分析活性分析免疫印迹杂交免疫印迹杂交(WESTERNBLOTTING)(WESTERNBLOTTING)免疫沉淀或共沉淀免疫沉淀或共沉淀(IP(IP或或COCO--IP)1D2DEMSACHIPIP)1D2DEMSACHIP等等��实验材料实验材料细胞细胞组织组织固定组织或石蜡包埋组织固定组织或石蜡包埋组织微生物微生物酵母酵母植物植物提取提取RNARNA后的后的剩余的蛋白样本等剩余的蛋白样本等��目的蛋白的结构目的蛋白的结构性质与分布性质与分布分布于胞桨分布于胞桨//胞核胞核//膜膜可溶可溶//不可溶不可溶含量多少含量多少分子量大小分子量大小四级结构四级结构特征特征磷酸化等修饰磷酸化等修饰…………��方法的选择方法的选择11自行配制抽提试剂自行配制抽提试剂,,根据文献方法或经验提取根据文献方法或经验提取((案例分析与技术要点案例分析与技术要点))22购买商品化试剂盒购买商品化试剂盒,,按其说明书的方法提取按其说明书的方法提取((产品选择指南产品选择指南))三三案例分析案例分析----细胞中总蛋白的制备细胞中总蛋白的制备��细胞加入细胞加入裂解液裂解液轻摇轻摇1515--3030分钟分钟��离心收集上清即得全蛋白样本离心收集上清即得全蛋白样本��蛋白定...
