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第四章生物化学与分子生物学技术实践第一节生物成分的分离与测定技术蛋白质的分离与纯化•蛋白质的性质蛋白质的性质•蛋白质分离和纯化蛋白质的分离步骤蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定蛋白质纯度等的测定蛋白质纯度等的测定蛋白质存在于生物体的组织细胞蛋白质存在于生物体的组织细胞中，不同的生物体组织细胞所含的蛋中，不同的生物体组织细胞所含的蛋白质种类、数量也不尽相同。白质种类、数量也不尽相同。一、蛋白质的性质•蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。•在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳。11、蛋白质的两性离解和电泳现象、蛋白质的两性离解和电泳现象•由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。•由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。22、蛋白质的胶体性质、蛋白质的胶体性质•蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。•改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质•在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。33、蛋白质的沉淀作用、蛋白质的沉淀作用•在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。•在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。•可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。可逆沉淀可逆沉淀•在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。•由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。•如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。不可逆沉淀不可逆沉淀•蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性。44、蛋白质的变性、蛋白质的变性蛋白质的变性•变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强碱等。•大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。•这三种氨基酸的在280nm附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm附近显示强的吸收。•利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。55、蛋白质的紫外吸收、蛋白质的紫外吸收要研究某种蛋白质的结构、性质要研究某种蛋白质的结构、性质和功能，就必须将这种蛋白质从组织和功能，就必须将这种蛋白质从组织细胞中分离、纯化出来。因此，蛋白细胞中分离、纯化出来。因此，蛋白质的分离与纯化技术便成为蛋白质研质的分离与纯化技术便成为蛋白质研究的重要技术。究的重要技术。二、蛋白质分离和纯化•研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。•(1)蛋白质来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞；•(2)随时测定蛋白质活性并检测蛋白质含量。•(3)分离和纯化过程都必须在温和的条件下进行。•(1)生物组织的机械破碎。常用的方法有研磨法、超声波法和酶解法等。•(2)根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提。•水溶性蛋白用中性缓冲溶液（透析液）抽提，酸性蛋白用稀碱性溶液抽提，脂溶性蛋白用有机溶剂抽提等。•(3)粗提:离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。•(4)提纯：可用层析法、电泳法等进行提纯。•(5)成品加工：测定蛋白质的性质并干燥成成品。1．蛋白质的分离步骤血红蛋白提取和分离步骤具体操作步骤（一）（二）（三）（四）血液血浆...