RNA原位杂交实用技术VIP免费

植物学通报2fi02，19(2)：234—238Chbtt~血lD，BottmyRNA原位杂交实用技术徐云远种康。许智宏谭克辉(中国科学院植物研究所北京100093)摘要利用互补RNA为探针进行原位杂交是分析组织或细胞内RNA分布的行之有效的方法，通过对mRNA分布的研究可以了解特定基因的表达情况。原位杂交技术过程较长，操作繁琐，从而在一些实验中不能得到很好的使用，为此本文根据莪们过去的实际操作经验对该技术中的一些使用技巧作简要的介绍。关键词原位杂交，基因表达Thelh-aetiealTechniqueof／ns／tuHybrldi~allonwithRNAProbeXUYtm-YuanCHONGKaIlgXUZhi-HongTANKe-Hui(f矿B栅．dA枷鼬，Be100093)Abs咖d5hybridizationwithcomplementRNAprobeisa|lefectivemethodtodetectⅡdistributionofRNAintissueoroeⅡ．bvwhichtheexpmssmnpatternofgenecflnconsequentlyberevealed．Asthecompleteprocessislongerandmore㈣p】thanothermolecularhybfidizati呷，theapplicationofthisme~od．howeverislimitedinc(lrr·1la】mb0+Inordertorr1aI∞thistechniquebeusedwld~lyinroutineexperiments，thepracticalskillswereintroducedbasedonpastexperience+Keywords／ns／tuhybridization，Expressionofgene随着越来越多的基因被克隆，探索这些基因的表达模式是研究其功能的重要环节之一。利用Noahem杂交可以说明特定基因在不同器官不同时期的表达情况，如果要在显微或亚显微水平对一些基因的时空表达进行研究，Northern杂交就显得无能为力根据核酸分子杂交的基本原理和免疫组织化学的成熟方法而发展的原位杂交技术(ISH，insituhybridization)(GallandPardue，1969；Johneta／，1969)为我们提供了行之有效的途径。利用RNA作为探针，与组织内的RNA靶序列杂交，这样可以了解组织或细胞内RNA的分布和数量，而且与DNA探针相比，使用RNA探针有其独特的优点：RNA：RNA热稳定，所以杂交反应结束后可以用高严谨条件洗涤降低背景；cRNA：RNA酶稳定．杂交反应结束后可以用RNase进行酶解除去游离的RNA探针，以降低背景；杂交效率高，根据Cox等(1984)的计算，探针浓度在2nl一6~g／ta时，RNA探针的杂交百分比是DNA探针的8①中科院剖新工程项目、国家"973”项目(G19990116)、国家自然科学基金项目(30170094)和中国博士后科学基金项目资助。@通讯联系^。&llhorforo0础∞作者简介：榇云远．男．38岁，副研究员先后在兰州大学获学士、硕士、博士学位，现为中科院植物所博士后，目前主要从事植物发育的分子生物学研究。收穑日期：20ol4)5．21接受日期：20014：6-10责任编辑：刘晖维普资讯http://www.cqvip.com维普资讯http://www.cqvip.com植物学通报19卷原位杂交技术基本上包括探针标记、组织固定、包埋、切片、粘片、脱蜡、蛋白酶消化、乙酰化、预杂交、杂交、洗片、免疫检测、封片、照相这些步骤。我们曾使用该技术分析小麦春化相关基因的表达模式，这里仅就应用过程中的一些细节和经验作一介绍，供同行参考。l探针的选择为提高探针的专一性，用作转录RNA探针的DNA片段应与靶序列以外的核酸序列无同源性，所以在转录之前就应考虑所选序列的特点。为使杂交时探针能顺利到达靶序列附近，RNA探针长度一般为50—3O0个核苷酸。考虑到组织切片深层细胞要求探针有一定的通透性，表层组织可能存在靶序列的不足，所以我们选用长度为100和500个核苷酸的等摩尔棍台物，这样既有一定的通透性又不致于使DIG的密度太低。如果所得DIG标记RNA过长，可以温和碱水解的办法达到所需要求(SchwarzacherandHeslop-Harrison，2000)。考虑到对试剂盒中DIG-dUTP的充分利用，建议所选模板长度尽可能接近探针的长度。所以在合成探针时还要考虑的是模板长度。根据实验的需要，把将要用作RNA探针的模板的DNA片段构建在适当的启动子中问(例如T7和13之间)，在探针台成之前选用不会产生3’突出末端的限制性内切酶在T7(或rI3)的下游一定长度处进行完全酶解以对质粒进行线性化，纯化后用作I7RNA聚合酶(或13RNA聚台酶)的模板。2探针的标记对探针的标记主要是利用放射性同位素、酶分子、荧光素、半抗原或生物素，这些标记物的检测已经十分完善，国内外的一些公司都有相应...