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2012-10-10DMEM/F12培养基配制gibcoD-MEM/F-12CAT.NO.12500-062LOT.NO.1206536干粉培养基，每包装配1L。直接溶于1L纯净水中，加2.438g碳酸氢钠，搅拌2小时，pH试纸检测中性。0.22μm滤器过滤180ml培养基入250ml血清瓶。5瓶180ml，1瓶不到180ml。其中1瓶180ml培养基加入FBS20ml。2012-10-11CHO-S细胞复苏：41℃迅速溶解1min；2ml细胞液+6mlDMEM/F1210%FBS加入离心管，轻柔吹散。离心1000rpm5min；弃上清；加入3mlDMEM/F1210%FBS，轻柔吹散,加入75ml细胞方瓶，补3mlDMEM/F1210%FBS；轻柔混匀，镜下观察，细胞密度85%-90%，细胞呈圆形悬浮；37CO2℃培养；2012-10-12细胞观察：贴壁，90%密度；95%呈圆形，少量有梭型倾向，密度过高，决定传代；细胞传代：13:00弃上清；加入胰酶，2滴管（37℃回温）；室温显微镜下观察，有微量脱落，1min；倒出胰酶，加入5mlDMEM/F1210%FBS，9区吹扫程序3次；1传2，补2.5mlDMEM/F1210%FBS；原瓶中还有未脱落细胞，又加入5mlDMEM/F1210%FBS继续培养，胶布标记。2012-10-13观察细胞状态：贴壁，有少量呈梭型，大部分为原型，但并不圆润。2012-10-15观察细胞：大部分为梭型，少量为原型，约80%，培养基开始变浅。细胞传代：两瓶量多的1传2；2012-10-16观察细胞：传代时分散不好的细胞过夜培养后镜下观察，成团状生长，有展开细胞。换培养液：13:00未脱落细胞换液，生长良好。配PBS:NaCL1.6g,KCL0.04g,KH2PO40.04g,Na2HPO4.12H2O0.726g,H2O200ml,高压灭菌。2012-10-17胰酶消化分散传代：PBS清洗2遍；胰酶侵润，立即倾倒或保持；显微镜下观察1min；加入5ml培养基；吹扫分散，1传2；2012-10-18细胞观察：尹骏传代的4瓶有2瓶没贴壁，我怀疑是第一次做的时候胰酶消化的时间过长，损伤了细胞壁；（需要严格控制消化时间，尤其注意，胰酶在倒出后，应立即加入终止培养基。）我传代的6瓶贴壁生长正常，但还是有团块生长；（这种团块生长可能是第一次传代为吹匀所致，并不是第二次传代可以吹散的，计划降低接种比例，延长生长时间，逐步减少团块数量。）2012-10-19配制胰酶：lifescience进口分装胰酶；0.25%，100mlPBS溶解；0.22μm过滤；冻存液配制：5%DMSO，250μLDMSO，4750μL含血清培养基。细胞冻存：选密度较高，展开细胞较多，团块较少的4瓶细胞消化冻存；倒掉培养基；2ml胰酶，室温60秒静置；倒掉胰酶；加入5ml培养基，9区吹扫，液面下吹打80次；1000rpm离心5min；倒掉上清；加入冻存液；立即放入4℃，1h；-20℃，3h；液氮口过夜；装入液氮存储核；6B41\6B42\6B34\6B22其中有一只冻存管细胞较少，已标明。细胞传代：一瓶1传2；一瓶1:4传代。（新配的胰酶很好用，细胞容易打散）2012-10-20尹骏传代的两瓶贴壁不好的细胞今日换液，去除死细胞2012-10-21细胞观察：1:4传代的一瓶（原瓶）培养基变黄，细胞贴壁展开非常好，比其他几瓶都好，未见染菌。推测细胞展开良好，没有接触抑制，代谢旺盛，生长迅速。建议立即换液。细胞换液：1:4传代的一瓶（原瓶）2012-10-22细胞观察：前日培养基颜色变化很大的一瓶细胞，换液过夜后颜色变化依然很大，并且细胞形态由展开向收缩发展，决定放弃。细胞传代：取三瓶细胞形态较好的1:4传代；共传6瓶，计划4瓶冻存，2瓶用于DNA提取；使用吸管吹散，细胞分离不完全，见2-8个聚集。培养基配制：从马格非分装血清中分出80ml，其中20ml加入180ml培养基中待用，60ml储存。细胞复苏：尹骏复苏了2012-10-19冻存的细胞一只。2012-10-24细胞观察：22日1:4传代细胞有聚集有展开，不是最佳状态，可能不适于冻存，原因可能是上次用吸管吹的力度比较小，为完全吹散；按照罗成的建议可以适当这延长消化时间，尽量减少吹打的损伤；胰酶消化和枪吹散哪种更损伤细胞？2012-10-25细胞冻存：冻存4只细胞（有一只打破了还剩3只）冻存液配制：10%DMSO，400μLDMSO，3600μL含血清（10%）培养基。细胞冻存：倒掉培养基；PBS漂洗2遍；2ml胰酶，室温70秒静置；倒掉胰酶；加入5ml培养基，9区吹扫，液面下吹打80次；1000rpm离心5min，弃上清；加入1ml冻存液，迅速混匀；41h℃，-202h℃，液氮口过夜（绳子太长了接触到液氮了），放入液氮存储盒里，6B34/6B...