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细胞冻存、复苏、传代、转染VIP免费

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细胞培养系列方法【实验前准备】(1)实验前准备好高压的离心管、冻存管、1ml/100ul枪头、PBS溶液。(2)清洁超净工作台面,照紫外30分钟;同时根据需要将培养基、胎牛血清、胰酶PBS液、双抗置于室温下复温。细胞的冻存与复苏【实验用品】(1)材料:培养的贴壁细胞(70%-80%融合)、于液氮中冻存的细胞(2)试剂:PBS液、0.25%胰蛋白酶液、DMEM培养基、胎牛血清、二甲亚砜(DMSO)、双抗(3)设备:培养瓶、巴氏吸管、15ml离心管、1.5ml冻存管、盛酒精的喷壶、酒精灯、水浴锅、CO2培养箱、离心机、液氮灌、倒置显微镜、超净工作台。试剂配制:(1)完全培养基含90%DMEM培养液加10%的胎牛血清加1%的双抗。(2)冻存液含80%的DMEM培养基加10%的胎牛血清加10%的DMSO,用吸管混匀,置于4℃冰箱中备用。细胞的冻存(1)依照传代的方法用0.25%胰蛋白酶液对处于对数生长期的单层细胞进行消化。(2)收集消化细胞于离心管中,800-1000r/min离心5min。(3)弃上清液,加入适量冻存液,用吸管吹打细胞制悬,调整细胞密度为5*106-1*107个/ml。(4)每个冻存管分装细胞悬液1.5ml,旋紧冻存管的盖,并用封口膜密封。(5)在冻存管上标明细胞的名称、冻存时间、冻存人名等。(6)将冻存管置于如下条件下逐步加以冻存:4℃,0.5h→-20℃,1h→-80℃,过夜→转入液氮灌中。细胞的复苏(1)准备水浴锅,调温度至38℃。打开离心机。(2)用止血钳从液氮灌中取出细胞冻存管1只,迅速将其置入38℃水浴锅中,不断摇动使冻存的细胞悬液尽快融化。(3)用酒精棉球擦拭冻存管,放入超净工作台中。(4)将已融化的细胞悬液用吸管移入离心管中,加10倍体积的DMEM培养基,吹打混匀。(5)1500r/min离心4min,弃上清液。(6)加入培养液吹打沉淀的细胞,使其悬浮,对细胞进行计数。(7)按5*105个/ml的细胞浓度,将细胞接种在培养瓶中,置于培养箱中培养。(8)24h后取出培养瓶,观察细胞生长状况。【注意事项】(1)对数期的细胞增值能力强,冻存后生存率较高,因此,在进行细胞冻存时,应尽量选择处于此期的细胞加以冻存。(2)为了保证复苏后细胞的存活率,复苏接种时,细胞的浓度不能太低,最好控制在5*106-1*107个/ml,这样才能保证复苏成功。(3)冻存管的瓶盖应封盖严密,以免复苏时细胞外溢。(4)复苏时,从液氮取出冻存管到水浴中融化的过程要快,否则会导致冰晶的形成,伤害细胞。同时,一次复苏的冻存管数量不要太多,否则会引起水浴锅中传热不佳,延缓冻存的细胞悬液融化的时间。(5)为防止液氮冻伤,注意戴上防护手套。【实验结果及分析】经复苏刚接种的细胞是悬浮于培养基中的。复苏成功的细胞24h左右可贴壁,48h后即可开始生长、增殖。复苏不成功的细胞,将继续悬浮于培养液中,不能贴壁。细胞的传代培养【实验用品】(1)材料:原代培养的肝细胞、原代培养的外周血淋巴细胞(2)试剂:PBS液、DMEM培养基(含10%小牛血清)、0.25%胰蛋白酶消化液(3)设备:25ml培养瓶、吸管、离心管、酒精棉球、酒精灯、离心机、倒置显微镜、超净工作台、C02培养箱【实验方案】1.贴壁细胞的传代培养(1)用吸管吸出原代培养的肝细胞培养瓶中培养液。(2)向瓶内加入适量的PBS液,轻轻摇动后倒掉。(3)每25ml的培养瓶内加入0.25%胰蛋白酶消化液1ml,消化液的量以覆盖整个细胞培养面为宜,置于37℃的培养箱环境中。轻轻摇动培养瓶,在倒置显微镜下对培养细胞进行观察,当细胞胞质回缩、细胞间隙增大时,迅速将消化液吸出。(4)加入PBS液于培养瓶中,轻轻转动培养瓶,然后用吸管将溶液吸出,加入含血清的培养液终止消化。(5)用吸管吸取培养液,反复轻轻吹打瓶壁,制备细胞悬液。吹打的部位应均匀,可按从上到下、从左到右的顺序进行,保证瓶底各个部位的细胞均能被吹到。此外,吹打时不能用力过猛,尽量不出现气泡,以免损伤细胞。(6)将吹打后的细胞置于倒置显微镜下观察,当发现原贴壁的细胞均已悬浮于培养液中,成片的细胞已分散成小的细胞团或单细胞,即可终止吹打。(7)收集细胞悬液于离心管中,1000r/min,离心5-8min,去除上清。(8)细胞计数,按照1*105-1*106个细胞的密度接种细胞于新培养瓶中。2.悬浮细胞的...

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