http://www.paper.edu.cn-1-发育期大鼠反复高热惊厥激活内质网应激1刘晓燕，秦炯，杨志仙，韩颖，陈静北京大学第一院儿科，北京（100034）E-mail：qinjiong@263.net摘要：目的研究反复高热惊厥（febrileseizures，FS）对发育期大鼠ACTH及葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulatedprotein78，Grp78）的影响，探讨FS与内质网应激的关系。方法40只21日龄SD大鼠，采用热水浴诱导大鼠惊厥，隔日1次，共10次。大鼠随机分为两组:正常对照组和高热组,根据惊厥与否进一步将高热组分为高热对照组和反复FS组。采用放射免疫分析法测定各组大鼠血浆中ACTH水平，用免疫组织化学法和蛋白免疫印迹(Westernblotting)检测各组大鼠大脑皮层和海马神经元Grp78蛋白的表达水平。结果与对照组和高热组比较，反复FS组大鼠血浆ACTH水平显著升高（P﹤0.01），皮层及海马Grp78蛋白表达也明显增强。结论反复FS可引起下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴（HPA）激活，诱导脑内Grp78蛋白表达增加，导致内质网应激。关键词：高热惊厥，葡萄糖调节蛋白78，内质网应激癫痫是小儿时期最常见的慢性神经系统疾病之一[1]，以反复惊厥发作为特点。当惊厥反复发作而未能很好控制时，有导致进行性脑结构（如海马）损伤的危险，并且可能造成认知的损害[2-3]。我们课题组借鉴国外文献[4]，建立了热水浴诱导发育期大鼠高热惊厥（febrileseizures，FS）的模型[5]，应用此模型证明单次惊厥发作后，大多数发育期大鼠脑功能和结构良好，而反复FS大于6次即可造成脑损伤[5-6]。目前惊厥性脑损伤的发病机制尚不明了。最近的研究表明，内质网应激在许多神经系统疾病特别是神经退行性疾病的发病机制中可能起着重要作用[7]。机体处于应激状态时，下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴（HPA）常发生相应的改变；在整体应激出现明显改变之前，在细胞的亚细胞器水平和分子水平可能已经发生了应激相关分子的改变。葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulatedprotein78，Grp78）为内质网的标志分子伴侣，广泛存在于各类哺乳动物细胞的内质网腔中[8-9]，在内质网应激状态下，它的表达上调，以维持细胞内环境的稳定。本研究应用热水浴诱导大鼠惊厥模型，观察反复FS前后大鼠血浆ACTH水平及脑组织Grp78蛋白表达的变化,来探讨反复FS时是否存在整体应激及内质网应激，以期揭示内质网应激与惊厥性脑损伤可能的相关性。1．材料与方法1.1反复高热惊厥动物模型的建立和实验分组21日龄SD大鼠（购自维通利华）40只，雌雄各半，体重50～70g。随机分为正常对照组（n=12，37.0℃水浴）和高热组（n=28，44.8℃热水浴）。大鼠在热水浴中5min如果不发生惊厥则到时取出，5min内发生惊厥者则惊厥开始即刻取出,隔日热水浴处理1次，共10次。高热组又按大鼠惊厥与否进一步分为高热对照组（n=12）和FS组（n=16）。1.2标本的取材和制备1本课题得到国家自然科学基金项目（No.30571969）；北京市自然科学基金项目（No.7063096）；教育部高校博士点基金项目（No.20040001114）的资助。http://www.paper.edu.cn-2-所有大鼠在最后一次水浴处理后8h左右取材。腹腔注射10%水合氯醛麻醉,经腹主静脉取血2ml，注入含10%EDTA二钠30µl和抑肽酶20µl的试管中，混匀，4℃离心10min（3000rpm/min），分离上清，编号，置-20℃冰箱保存，用于测定ACTH含量。用于免疫组化染色的动物（n=20）取血后打开胸腔,经左心室快速灌注生理盐水10～30ml，继而以4%多聚甲醛（0.1mol/L磷酸缓冲液配制）灌注进行内固定，断头取脑，置上述缓冲液中后固定18～20h，30%蔗糖（0.1mol/L磷酸缓冲液配制）置换3日至脑组织沉底，液态氮速冻，冰冻冠状切片，切片厚度8µm，晾干，置-80℃冰箱保存。用于Westernblotting试验的动物（n=20）取血后迅速断头取脑，分离出皮层及海马，用标号锡箔纸包好投入液氮中，移入-80℃冰箱备用。1.3血浆ACTH含量测定ACTH放射免疫测定试剂盒购于北京北方生物技术研究所。测定之前，将样品从-20℃取出，室温复融，4℃离心5min（3000rpm/min），取上清测定。操作步骤参照试剂盒说明书。1.4免疫组化检测Grp78蛋白表达免疫组织化学试剂盒购自天津灏洋生物制品公司。操作流程参照试剂盒说明书。使用微波进行抗原修复，DA...
