基因工程药物——促红细胞生成素（EPO）EPO的概念EPO的用途及其疗效EPO的纯化历史及工艺流程EPO的销售情情况及其前景什么是EPO？EPO：是促红细胞生成素（Erythropoietin）的英文简称。促红细胞生成素：最初是从肾脏中分离出来能刺激前体红细胞增生、分化的一种细胞因子。人体血液中的促红细胞生成素：是由肾脏和肝脏分泌的一种激素样物质，能够促进红细胞生成。它与其受体(EPO-R)结合后共同介导缺氧的生理反应。EPO的用途医疗用途：增加红血球的数目，用于贫血、组织断离、早产儿，用在癌学和血液学方面。体育用途(兴奋剂)：增加训练耐力和训练负荷，属于国际奥委会规定的违禁药物。在2008年北京奥运会中第一例的兴奋剂。EPO的疗效1、肾性贫血患者EPO水平较低，在进行治疗过程中，往往通过注射EPO来提高体内EPO水平进行治疗，从而帮助病人增加红细胞数量，此时EPO水平有所上升。2、其他贫血如缺铁性贫血、巨细胞性贫血患者EPO水平不降低，但也可以使用EPO治疗，此时浓度也会有所升高。3、再生障碍性贫血和骨髓造血功能不全患者EPO水平升高。EPO的纯化历史1、Miyake的七步法：纯化步骤太多，对设备及操作要求也较高，不适合工业生产的特点。2、Spivik利用凝集素亲和层析纯化EPO：由于凝集素亲和层析凝胶易被杂蛋白不可逆吸附，使得分离效果降低，成本增高，也不利于大规模生产。3、近年来则利用三步层析法三步纯化基本流程等。EPO的工艺流程——①三步层析法三步层析法11、染料配基亲和层析→反相疏水层析→离、染料配基亲和层析→反相疏水层析→离子交换层析子交换层析;;22、染料配基亲和层析→反相疏水层析→分、染料配基亲和层析→反相疏水层析→分子筛层析子筛层析;;33、反相疏水层析→离子交换层析→分子筛、反相疏水层析→离子交换层析→分子筛层析。层析。EPO的工艺流程——②三步纯化基本流程三步纯化基本流程第一步：反相柱色谱第一步：反相柱色谱样品浓缩约样品浓缩约96.7%96.7%透析透析第二步：第二步：DEAE-DEAE-离子交换色谱离子交换色谱第三步：分子筛色谱第三步：分子筛色谱总回收率总回收率〉〉30%30%比活比活1.1.5*105*1088U/gU/g蛋白蛋白第一步：反相色谱第一步：反相色谱C6C6反相柱（反相柱（2cm*2cm2cm*2cm）（创新生物技术）（创新生物技术公司）公司）流程：流程：上样上样50ml/min50ml/min（柱结合量约（柱结合量约5mg5mg蛋白蛋白/ml/ml介质介质))去离子水去离子水平衡至检测基线平衡至检测基线10%~80%10%~80%乙醇胍乙醇胍线性梯度洗脱线性梯度洗脱检测并收集含检测并收集含EPOEPO主峰主峰ELISAELISA测定测定结果：结果：60%60%乙醇乙醇-1mol/L-1mol/L盐酸胍盐酸胍洗出洗出EPOEPO透析透析透析液：透析液：1010倍体积的倍体积的10mmol/LTris.HCl(p10mmol/LTris.HCl(pH7.5)-2%H7.5)-2%蔗糖缓冲液蔗糖缓冲液透析次数：透析次数：22时间：时间：5~6h5~6h第二步：离子交换柱第二步：离子交换柱DEAEDEAE型离子交换柱型离子交换柱流程：流程：10mmol/L10mmol/LTris.HClTris.HCl(pH7.5)(pH7.5)缓冲液缓冲液平平上样上样20ml/min20ml/min（柱结合量（柱结合量20mg/ml20mg/ml））10mmol/LTris.HCl(pH7.5)10mmol/LTris.HCl(pH7.5)缓冲液平衡缓冲液平衡至基线至基线添加添加NaClNaCl入缓冲液，进行入缓冲液，进行截状梯度洗脱截状梯度洗脱（（NaClNaCl浓度分别为：浓度分别为：5050，，7070，，125mmol/L125mmol/L））结果：结果：ELISAELISA检测盒表明检测盒表明75mmol/L75mmol/L洗脱洗脱峰中含峰中含EPOEPO第三步：分子筛色谱第三步：分子筛色谱SephacrylS-200SephacrylS-200色谱分析色谱分析流程：流程：上样体积上样体积80ml80ml流速流速2ml/min2ml/min流动相流动相20mmol/L20mmol/L柠檬酸钠柠檬酸钠-100mmol/LNaCl-100mmol/LNaCl缓冲液缓冲液结果：结果：收集的收集的rHuEPOrHuEPO保留时间约为保留时间约为45min45min比活性约为比活性约为1.5*101.5*1088U/gU/g蛋白；纯度〉蛋白；纯度〉98%98%（（SDS-PASDS-PAGEGE检测）检测）免疫原性检测：免疫原性检测：WesternblotWesternblotEPO的销售情况重组...
