人骨形成蛋白-7成熟肽cDNA的克隆和序列测定关键词:骨形成蛋白-7;克隆;序列测定中号:Q786文献标识码:B文章编号:1007-8738(2000)03-0213-02▲人骨形成蛋白?7(hBMP?7)最早由Celeste等〔1〕克隆并命名。同年,Ozkaynat等〔2〕从人脑cDNA文库中也筛选出此克隆。以后研究表明,BMP?7除了诱导成骨外,还具有广泛的生物学活性〔3-6〕。由于hBMP?7在神经系统及造血组织中的特殊作用,故其在基础研究和临床应用中具有广阔的前景。我们采用自行设计合成的一对特异性引物,以骨肉瘤的λgt11噬菌体表达文库为模板,通过PCR扩增到hBMP?7成熟肽的cDNA。将其克隆入载体pGEM?3zf(?),所获序列与已发表的序列完全一致,为进一步对其表达和功能研究创造了条件。1PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析1:PCRmarker(从上至下为:1543,994,697,515,377和237bp);2:PCR产物.2重组质粒pGEB7的酶切鉴定1:PCRmarker(从上至下为:1543,994,697,515,377和237bp);2:重组质粒pGEB7的EcoRI+HindIII双酶切.1材料和方法1.1材料大肠杆菌DH5α及质粒pGEM?3zf(-)均为本室保存。骨肉瘤细胞U2-OS的λgt11噬菌体表达文库为本室构建。各种限制性内切酶、连接酶和Taq酶均为Gibco公司的产品。AdvantagePCR-purekit为Clontech公司产品。常用试剂为进口分装或国产分析纯。PCR扩增引物自行设计,由上海生物工程中心合成。引物的序列如下:P1:5′TTTAAATGTCCACGGGGAGCAAAC3′;P2:5′GCGTCGACTTAGTGGCAGCCACAG3′.1.2方法1.2.1hBMP?7成熟肽基因的扩增PCR反应体系:P1和P2引物(20mmol/L)各1μL,dNTP(10mmol/L)1μL,模板λgt11噬菌体3μL,10×PCRbuffer5μL和Taq酶1U,加水至总体积50μL。PCR反应条件:94℃30s,50℃30s,72℃30s反应5个循环。然后,于94℃30s,55℃30s,72℃30s,反应30个循环。PCR产物用15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.2.2重组质粒的构建用HincII酶切载体pGEM?3zf(-)并回收,同时回收PCR产物,用T4连接酶连接,转化感受态细胞DH5α,筛选阳性克隆。1.2.3序列测定利用PE公司ABI310型全自动核酸测序仪进行。2结果2.1hBMP-7成熟肽基因的扩增以λgt11噬菌体表达文库为模板,利用自行设计的一对引物,进行PCR扩增hBMP-7成熟肽基因。经两段反应共35个循环后,用15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定,获得约440bp的特异条带,与预期的大小相一致(1)。2.2重组质粒的构建回收440bp片段,在T4连接酶作用下,与用HincII酶切的质粒pGEM?3zf(-)于16℃连接过夜。以连接产物转化感受态细胞DH5α,加入IPTG和X-gal进行蓝白筛选。随机挑取白色克隆,提取质粒,用限制性内切酶EcoRI和HindIII双酶切。经15g/L琼脂糖凝胶鉴定表明,切出440bp片段者为阳性克隆(2),将此重组质粒命名为pGEB7。2.3序列测定利用PE公司ABI310型全自动核酸测序仪测定hBMP?7成熟肽基因的序列,所得结果与已发表的序列完全一致(3)。TCCACGGGGAGCAAACAGCGCAGCCAGAACCGCTCCAAGACGCCCAAGAACCAGGAAGCC(60)CTGCGGATGGCCAACGTGGCAGAGAACAGCAGCAGCGACCAGAGGCAGGCCTGTAAGAAG(120)CACGAGCTGTATGTCAGCTTCCGAGACCTGGGCTGGCAGGACTGGATCATCGCGCCTGAA(180)GGCTACGCCGCCTACTACTGTGAGGGGGAGTGTGCCTTCCCTCTGAACTCCTACATGAAC(240)GCCACCAACCACGCCATCGTGCAGACGCTGGTCCACTTCATCAACCCGCAAACGGTGCCC(300)AAGCCCTGCTGTGCGCCCACGCAGCTCAATGCCATCTCCGTCCTCTACTTCGATGACAGC(360)TCCAACGTCATCCTGAAGAAATACAGAAACATGGTGGTCCGGGCCTGTGGCTGCCACTAG(420)3BMP?7成熟肽编码基因的部分核苷酸序列3讨论hBMP-7具有广泛的生物学活性:①胚胎发育中所产生的BMP-7和BMP-4是诱导交感神经元分化的信号分子。②能抑制胚胎癌性细胞(ECC)的增殖,诱导其分化,可能对一些干细胞肿瘤有治疗价值。③对牙齿的修复、形成有重要作用。④对鼠胚胎菱脑的发育和形成有一定影响,为哺乳动物眼部发育所必需〔5〕。剔除(knock?out)该基因的小鼠出生不久即死于肾脏发育不良,提示其可能与小儿肾功能不良所致贫血和骨骼发育不良有关,从而使其在基础研究和临床应用等方面具有比较重要的价值。但天然来源的BMP-7较少,限制了对其功能的研究。国外多用真核表达系统表达BMP-7,只有极少数人尝试用原核表达系统进行表达研究...