PC12细胞培养PC12细胞是大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株,具神经内分泌细胞的一般特征,因其具可传代特点,广泛应用于神经生理和神经药理学研究。1.PC12细胞有两种:未分化型和分化型。其中未分化型的PC12细胞贴壁能力强,传代时需要胰酶消化,形状不规则。分化型PC12细胞传代时不需要胰酶,直接可以吹下来,形状规则。这两种细胞没有很大的区别,但我在实验中发现,未分化型的PC12细胞对药物的敏感性较之分化型的要差一些。2.由于PC12细胞是一种肿瘤细胞,在传代次数较多后,它的形状和性状会发生改变。这些改变尤见于未分化型PC12细胞。主要是细胞形状变得更加不规则,对药物的敏感性愈加下降。因此,建议长期用PC12细胞作实验的战友最好严格控制细胞的传代次数。3.在复苏细胞时动作一定要迅速,放入温水中1~2min后要马上加入培养液中,培养12~24小时后更换一次培养液,这样不仅可以把DMSO吸掉,而且可以将死亡的细胞也吸掉。细胞一天一看即可,经常动会有影响。注意过滤后血清的PH值,因为培养液过滤后PH值会有所改变。复苏后的换液时间取决于您复苏时是否洗涤离心细胞,去除了冻存液中的DMSO,如果没有去除DMSO,细胞培养过夜后就要彻底换液;如果复苏时洗涤离心过,可以待传代时再换液也可。(据我个人经验,还是复苏时去除DMSO,细胞的生长状态好一些)4.状态良好的细胞复苏后4h即可贴壁,开始增殖,大约2d即可传代,接种48h应该到了对数增长期。5.每天观察一两次细胞我不认为会对细胞的生长造成不良影响,不过每次观察的时间不易过长。6.传代时我认为最好不要用胰蛋白酶,因为胰蛋白酶对细胞有破坏作用。我以前用胰蛋白酶消化传代过PC12,结果传代后的细胞虽然贴壁,形态也好,但就是增殖缓慢,所以我现在都是用枪吸取培养液直接吹打,传代后细胞增殖迅速,2d就长满了(因为长的太快,我只好降低血清浓度,用5%FBS)7.传代的时机最好选在细胞生长旺盛,占瓶底70%-80%时最好,如果细胞长的太满,细胞的状态会越来越差,最后大片死亡;这种细胞传代后生长也不好;而且长的太满后,细胞贴壁牢,难于吹起来,相反,70%-80%时细胞很容易吹起来。8.如果细胞贴壁太紧,不得不用胰蛋白酶消化,注意低浓度,段时间,多洗涤。我一般用0.025%的胰蛋白酶,在镜下观察细胞突起收缩,有零星的细胞漂起就中止,或用肉眼观察,瓶底呈现薄雾状的模糊感时就中止,中止一定要彻底,要用含血清的培养液多洗涤离心几次,确保去除剩余的胰蛋白酶,否则传代后的细胞难以生长。9.就培养器皿的选用,我推荐在60mm的培养皿中培养传代,第一,在皿里细胞生长的更快,我想可能是皿比瓶的气体交换更好吧;第二,传代时吹打更方便,不易污染。细胞培养基DMEM的配制(初学)细胞培养基是由合成培养和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出售,它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、纤维素、碳水化合物、无机离子和其它辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。小牛血清含有一定的营养成分,更重要的是它含有细胞生长所必须的生长因子、激素、贴附因子等,这是合成培养基无法替代的。此外它还能中和有毒物质的毒性。故一般体外培养细胞时要加入一定量的小牛血清(10%)。【仪器、材料和试剂】1.仪器:蠕动泵1套,滤器,高压蒸汽灭菌锅,磁力搅拌器,pH计。2.材料:3000mL锥形瓶,250mL或500mL培养液瓶,0.22mm的微孔滤膜。3.试剂:双蒸水,小牛血清,合成培养基(DMEM),NaHCO3。【操作步骤】1.过滤器的准备和安装(1)清洗好过滤器,干燥(2)将一张0.22mm的微孔滤膜在DDW中浸泡后放入滤器,注意不要有气泡。(3)用布或报纸包装好,121℃30min进行高压蒸汽灭菌处理。(4)在超净台内安装好过滤装置,准备过滤。2.合成培养基的配制DMEM13.5gNaHCO33.7gHEPES2.38gDDW溶解10M的NaOH调pH为7.5定容1L(1)将干粉型培养基DMED溶于300ml的三蒸水中,再用300ml水冲洗包装内面两次,倒入培养液中,以保证所有干粉都溶解成培养液。(2)加入NaHCO33.7gHEPES2.38g。磁力搅拌器搅拌。完全溶解即可,不易在空气中搅拌过长时间,大量的CO2融入会影响培养基的pH(3)正...