Transwell是检测细胞侵袭能力的检测方法我们所使用的是Chemicon公司的ECM554,基质胶已经包被好了,买来就可以用,很方便,而且我们算过,跟自己买胶来包被价格相差不大。这种胶4度下很软,37度则变得比较坚硬,因此用前应先放在培养箱中10分钟作用,使胶完全凝固。该试剂盒对穿过膜的细胞进行荧光染色,再用裂解液裂解细胞后检测荧光值。我们在实际使用的时候对穿过膜的细胞采用1%结晶紫染色,镜下计数细胞数目。结晶紫也可以用33%醋酸溶解,再用酶标仪570nm检测,同样可以反应穿过细胞数因为基质胶的厚度直接影响穿过膜的细胞数,因此建议有条件的话还是买这类已经铺好胶的试剂盒,比较可靠。说明书该公司网上可以下载,对原理也有比较详细的阐述,可以去查一下。我们做的时候,上室用0.5%BSA的培养液,下室用5%血清的培养液,下室血清的浓度可根据细胞类型的不同进行调整,如果细胞侵袭能力强,可适当降低血清浓度,否则可适当提高血清浓度。需要注意的是:1。上室内的细胞数目要适当,过多,穿过膜的细胞会过多过快,如果用计数法的话将难以计数;最少也要保证在收样的时候,上室内还要有细胞存在。具体细胞密度需要自己摸索。2。细胞计数的准确性对结果影响很大,各组间最好不要分开计数。尽量用同一密度的细胞悬液给予不同处理,保证各组细胞量一致3。对细胞的处理不可影响细胞生存。否则难以肯定是细胞量的改变还是侵袭能力改变侵袭小室其实不止是transwell的,其它像Boydenchamber、Thincert也挺好用的。我用过Thincert,个人感觉不错,而且价格便宜,是grelner的,孔径8微米用于24孔板的一个才45块人民币,而且可以零买,不想transwell,总是一箱一箱的卖,实在是太贵了!侵袭实验要结合实验目的,不一定非要包被的。下面奉上用Thincert做侵袭实验的步骤(摘自《AquantitativecellmigrationassayusingThinCert™cellcultureinserts》,大家如需要,可用google搜之:1.Preparecellculturesaccordingtostandardcellcultureprocedures2.Starvecellsovernightinserum-freemediumwith0.2%BSA3.HarvestcellsandwashthemtwiceinPBS4.Resuspendcellsinserum-freemediumwith0.2%BSAtoanappropriatefinalcellconcentration(e.g.106/ml5.Place24wellThinCertTMcellcultureinsertsinthewellsofaCELLSTAR®24wellcellcultureplate6.Add600µlculturemediumwithorwithoutchemoattractanttoeachwellofthecellcultureplate7.Add200µlcellsuspensiontoeachcellcultureinsert8.Incubatethecellcultureplatefor3-24hinacellcultureincubatorat37°Cand5%CO29.Removethecellculturemediumfromeachwellofthecellcultureplateandreplaceitby450µlserum-freeculturemediumwith8µMCalcein-AM10.Incubatefor45mininacellcultureincubatorat37°Cand5%CO211.Removetheculturemediumfromthecellcultureinserts12.Transferthecellcultureinsertsintoafreshlyprepared24wellcellcultureplatecontaining500µlprewarmedTrypsin-EDTAperwell13.Incubatefor10mininacellcultureincubatorat37°Cand5%CO2,agitatetheplatefromtimetotime14.Discardthecellcultureinsertsandtransfer200µloftheTrypsin-EDTAsolution(nowcontainingthemigratorycellsfromeachwellintoablackflatbottom96wellplate15.Readfluorescenceinafluorescenceplatereaderatanexcitationwavelengthof485nmandanemissionwavelengthof520nm从第9步开始计数侵袭细胞时,这份说明书用的是荧光标记,但这种方法成本高而且繁琐。我做的时候改为giemsa染色,发现效果不错,具体如下:9.侵袭实验完成后,取出小室,用棉签小心将膜上表面的细胞擦拭去除;10.用手术刀片小心沿小室边缘将膜切下;11.把膜下表面向上放在一个洁净的24孔板的孔中;12.甲醇:冰醋酸(3:1固定10min后用10%giemsa染色;13.在显微镜下随机选取5个视野计数细胞(即染成紫红色的点,未着色的多为细胞碎屑计数并拍照留念Transwell细胞体外侵袭实验概述目的:总结并改进细胞体外侵袭实验的操作经验。方法:采用改进后细胞体外侵袭实验分别研究不同浓度TNFα刺激下的HCCC29810胆囊癌细胞体外侵袭能力的强弱;粉防己碱对HUVEC人类脐静脉内皮细...
