流式细胞术检测人和小鼠细胞内细胞因子方法的建立VIP专享VIP免费

流式细胞术检测人和小鼠Th细胞亚群早在1986年Mosmann等[1]依据小鼠分泌的细胞因子谱不同首次将Th细胞分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。Th1细胞主要分泌IL-2、、IL-12、IFN-γ和TNF-α等细胞因子，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反应。Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL13等细胞因子，其主要功能为刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫相关。由于Th1/Th2亚群及其相互之间的平衡在免疫应答的调节中起着关键的作用，Th1/Th2平衡的失调与多种疾病的发生发展和预后有着密切的关系。目前已发现许多感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病以及移植排斥反应等都与Th1/Th2平衡有关。因此建立稳定有效的细胞内因子检测方法对于准确说明Th1/Th2细胞的作用非常重要。目前检测的主要方法有酶联免疫法、ELISPOT法、荧光定量法及原位杂交等方法。流式细胞术检测细胞内因子是一种相对快速、重复性好并能准确定量的方法。我们参照国内外的一些文献，对于人和小鼠Th1和Th2细胞的流式检测方法进行了探索，并比较了两者之间的不同。由于未活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子极少，用流式细胞仪很难检测出来因此在检测前需刺激活化。目前国内外推荐的刺激物主要为PMA（佛波酯）和离子霉素（Ionomycin）。淋巴细胞在刺激物的作用下活化，分泌细胞因子到细胞外。由于流式细胞仪只能对细胞表面或内部的抗原进行检测，因此必须阻止细胞因子的分泌。抑制细胞因子分泌的试剂为BrefedlinA或莫能霉素（Monensin）。Th1/Th2细胞首先是CD4+T淋巴细胞。因此如何确定CD4+T淋巴细胞非常重要，我们主要围绕该问题进行探讨。材料与方法试剂PMA（Sigma）贮存液：PMA溶于DMSO浓度为0.1mg/ml-20℃保存。工作液：贮存液1:100稀释于RPMI1640培养基中，此时为1µg/ml。Ionomycin（Sigma）贮存液：Ionomycin溶于DMSO浓度为1mg/ml-20℃保存。工作液：贮存液1:20稀释于RPMI1640培养基中，此时为50µg/ml。GolgiStop（内含Monensin，BDPharmingen）Cytofix/Cytoperm液、Perm/Wash液和FACSLysingSolution，均购自BDPharmingen。抗体细胞表面标记抗体：抗人CD3-APC，CD8-PercP，CD8-CYC，CD4-CYC。抗小鼠CD4-CYC、CD8PE。细胞内因子抗体：抗人IL-4-PE,IFN-γ-FITC。抗鼠IL-4-PE,IFN-γ-FITC。以上抗体均购自BDPharmingen。实验方法1外周血单个核细胞的分离：取肝素抗凝正常人或者Balb/c小鼠外周血1.5ml。在试管内加入淋巴细胞分离液3ml。将外周血以等体积Hanks液稀释后，轻轻加入淋巴细胞分离液上层。2000g离心20min。取出试管后，轻轻吸取液相交界的单个核细胞，加入Hanks液3ml，混匀后，1500g离心5min。弃去上清，细胞加入0.5mlRPMI1640培养基（含10%小牛血清，50μg/mlpenicillin和50μg/mlsteptomycin）重悬，血细胞计数仪计数，调整细胞浓度。2不同浓度的PMA刺激后人T淋巴细胞CD4、CD8和CD3的表达。24孔细胞培养板中，每孔加入约5×105个细胞，加入RPMI1640培养基至总体积1ml。加入不同浓度的PMA（10ng、20ng和50ng终浓度）和500ng/mlIonomycin共同刺激人外周血单个核细胞，同时加入0.7µlGolgistop，37℃CO2孵箱刺激4h。收集单个核细胞，分为三部分，分别加入CD8-CYC、CD4-CYC、CD3-APC单抗各10ul，室温避光孵育30min。加入红细胞裂解液（FACSLysingSolution）1ml裂解残余红细胞，2mlPBS洗涤细胞一次。流式细胞仪（FACSCalibur，BectonDickinson)检测细胞，Cellquest软件获取分析细胞，每个检测获取10000个细胞。采用前向角（FSC）和侧向角（SSC）散射光散点图设门区分淋巴细胞，以直方图分别表示CD3、CD8和CD4阳性淋巴细胞。3不同时间PMA和离子霉素刺激后小鼠T淋巴细胞CD4和CD8的表达。24孔细胞培养板中，每孔加入约5×105个细胞，加入RPMI1640培养基至总体积1ml。加入PMA和Ionomycin使终浓度分别为100ng/ml和1µg/ml，同时加入0.7µlGolgistop。37℃CO2孵箱刺激8h、12h分别收集细胞。采用抗小鼠CD4-CYC、CD8PE抗体标记T淋巴细胞，流式细胞仪检测CD4和CD8的表达。4流式细胞术检测人外周血Th1和Th2细胞。分离外周血单个核细胞，加入20ng/mlPMA和500ng/ml离子霉素刺激4h后，收集...