CD4+和CD8+T淋巴细胞检测操作细则1.目的根据《全国艾滋病检测技术规范》(2009年修订版)，对CD4+和CD8+T淋巴细胞检测(流式细胞仪FACSCalibur）的操作进行细化，以规范本中心CD4+和CD8+T淋巴细胞检测工作，保证结果准确。2.适用范围本操作细则适用于本中心CD4+和CD8+TT淋巴细胞检测。3.职责3.1检测人员负责按本操作细则进行CD4+和CD8+TT淋巴细胞检测。3.2复核人员负责对CD4+和CD8+TT淋巴细胞检测操作及结果进行复核。3.3科室负责人负责对检测工作进行综合管理。4.操作程序4.1方法：流式细胞仪单平台法。4.2设备：生物安全柜、振荡器、移液器、流式细胞仪FACSCalibur.4.4试剂：经国家食品药品监督管理局注册批准，批批检合格，在有效期内的商用CD4+和CD8+的检测试剂。4.5检测步骤4.5.1标本制备：4.5.1.1将试剂盒取出置于室温，平衡30分钟。然后按需要取出相应数目的绝对计数管TruCountTube，按顺序依次编号。4.5.1.2用反向加样法在Tube中加入50ul充分混匀的抗凝全血，注意血不要碰到试管底部的微球（Beads）。4.5.1.3取20ul荧光抗体加入到管中，注意：不要碰到血。涡旋混匀，室温避光放置15min。4.5.1.4取出加入450ul1×FACS溶血素，充分混匀，避光放置15min。4.5.1.524小时内上机用MultiSET软件获取细胞进行检测，上机前应充分混匀。4.5.2.FACSCalibur上机操作：4.4.2.1执行FACSCalibur开机程序，进入MultiTEST软件。4.4.2.2在出现的“Signin”窗口中输入操作者姓名、单位、领导姓名等相关信息，计算机将保存这些信息，单击“Accept”。4.4.2.3进入“Setup”窗口：在“DataSource”对话框中选择“FromCytometer:AcquisitionandAnalysis”，在“EntryLevelFileNamePrefix”中选择“Samplename”；在“AutomaticSavingOptions”中选择“DataFile”、“LaboratoryReport”、“PhysicianReport”，软件会自动生成一个文件，文件的默认路径Facstation\BDfile\Multiset\DDMMYY文件夹；在“ViewReports”中选择“Until‘Next’ButtonPressed”。4.4.2.4单击“Accept”，进入“FACSComp”窗口，单击“SkipFACSComp”。4.4.2.5进入“TestPrefs”窗口，在“PhysicianReportChoices”中，这一项可以是全选，运行了一种试剂，会自动报告相应的结果。在窗口的最下方点“LotIds”，跳出一窗口,点此窗口左侧的“AbsoluteCountBeads”,在此窗口右侧输入TruCounttube的批号和Beads总数（标在包装袋上），单击“Save”。单击“Accept”。4.4.2.6进入“Samples”窗口，在表格中输入相应的PatientName、ID、CaseNumber，在Panel中选择CD4/8/3Truc.4.4.2.7在窗口最上方的“Cytometer”的下拉菜单中，单击“InstrumentSetting”，在出现的新对话框中单击“Open”；打开此路径下Facstation\BDfile\InstrumentSetting\Calibur.LNW文件。调用仪器各个参数的条件，选好后单击“Set”，“Done”.4.4.2.8单击“RunTests”，上样，调整SSC电压和阈值后，单击“Acquire”。4.4.2.9获取完成后，可以人工调整各个门的大小，单击“Continue”；打印“PhysReport”。继续下一个实验，或单击“Quit”，“Don’tSave”，退出MultiTest软件。4.4.2.10执行FACSCalibur关机机程序后，依次关闭电脑、仪器、稳压器、变压器。4.4.2.11将仪器的压力阀打到减压位置。4.5.4注意事项4.5.4.1样本使用EDTA抗凝全血，室温放置，24小时内处理，处理前充分混匀。4.5.4.2取血时要采用反向加样法，即加样枪吸取血样时，打到第二档，放时打到第一档，保证血量的准确，减少误差。4.5.4.3染色和溶血步骤应在室温避光进行，并充分混匀过程中，尽量防止血样的飞溅，以免血样留在管壁上。4.5.4.4本实验为免洗试剂，操作简单，减少细胞的丢失提高工作效率和计数精确度。4.5.4.5TruCOUNT管2-25°C保存，从冰箱取出后，应恢复室温再打开封条，保证TruCOUNT管包装袋密闭，袋内干燥剂变成粉红色时，TruCOUNT管应弃去不用.4.5.4.6遵守HIV实验管理规范和生物安全守则。4.5.4.7严格防止交叉感染，操作时必须戴手套，穿着工作衣。4.5.4.8所有样品，洗涤液和各种废物、弃物都按传染物处理。4.5.4.94剩余样品及废弃物应经121℃高压20分钟或用次氯酸钠等消毒剂处理30分钟，方可带出实验室。4.5.4.10每次实验完毕，用消毒液清洁工作台。5.支持性文件5.1《全国艾滋病检测技术规范》（2009年修订版）。5.2流式细胞仪FACSCalibur中文操作手册和试剂使用说明书。
