高效液相色谱-电喷雾串联四级杆质谱法检测小鼠组织中花生四烯酸及其代谢产物VIP免费

第38卷2010年8月分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告ChineseJourrudofAnalytic8IChemistry第8期1089—1094DOI：10．3724／SP．J．1096．2010．01089高效液相色谱-电喷雾串联四级杆质谱法检测小鼠组织中花生四烯酸及其代谢产物谷艳1’2石先哲“赵素敏1顾群1路鑫1许国旺1(中国科学院大连化学物理研究所，中国科学院分离分析化学重点实验室，大连116023)2(沈阳药科大学药学院。沈阳110016)摘要采用反相高效液相色谱梯度洗脱，电喷雾串联质谱多反应检测模式，同时分离测定小鼠组织中花生四烯酸类代谢产物。组织样品经低温超声破碎细胞，采用乙酸乙酯进行两次萃取，LC．MS／MS检测。实验用3个内标，标准溶液稀释法建立了19种花生四烯酸类物质的标准曲线。方法学确证表明：各被测物质的线性相关系数均大于0．99；定量限(LOQ)为3—250峙／L；相对回收率在70．7％一123．O％之间；方法重复性(RSD)均小于20％。运用本法在小鼠肺、肝、脾组织中检测到了几种花生四烯酸类代谢产物，并对肺组织里的8种代谢产物进行了含量测定，结果为ll-羟基二十碳四烯酸(58．3±11．6)ng／g，15．羟基二十碳四烯酸(52．6±15．5)ng／g，前列腺素E2(210±102)n∥g，前列腺素D2(20．3±13．9)ng／g，前列腺素J2(39．2±15．9)ng／g，血栓素B2(58．3±28．4)．g／g，前列腺素F2。(3．8±6．0),g／g，花生四烯酸(1980士544)ng／s。本方法灵敏度高、重复性良好，为研究生物组织样品中花生四烯酸类物质的代谢状况提供了分析基础。关键词高效液相色谱一串联质谱；花生四烯酸；组织1引言花生四烯酸(AA)是一种在生物体内含量较高，分布最广的多不饱和必需脂肪酸，主要以磷脂的形式存在于细胞膜上，当生物体受到某种刺激如炎症时，在磷脂酶A：的作用下水解成游离的AA。AA主要经过3条代谢途径产生具有生物活性的二十碳衍生物。在环加氧酶(COX)的作用下生成前列腺素(PGs)和凝血嗯烷(TXs)；在脂氧化酶(LOX)的作用下生成白三烯(LTs)和部分羟基二十碳四烯酸(HETEs)。在细胞色素P-450单氧化酶的作用下产生环氧二十碳三烯酸(EETs)、二羟基二十碳三烯酸(DHETs)和HETEs⋯。AA及其代谢产物在体内发挥着重要的生物学作用，广泛参与免疫与炎症反应旧。J，维持血液循环畅通[6’7】，参与细胞信号转导旧’9j，促进胰岛素分泌¨吼11J。目前，生物样品中花生四烯酸及其代谢产物的分析方法主要有气相色谱一质谱法(Gc．Ms)¨2—41、液相色谱·质谱法(LC—Ms)¨L硒3和液相色谱串联质谱法(LC—MS／MS)¨7’砖。等。Gc．Ms分析前一般需要比较复杂的预处理步骤，包括样品纯化和衍生化，且该法不适合分析热不稳定的代谢物，如EETs。LC—MS和LC—MS／MS的前处理方法简单，经同相萃取柱纯化富集后，可分析花生四烯酸三条代谢通路中的主要代谢产物。但固相萃取法的莺现性较差。本研究采用经典的液液萃取法，反相高效液相色谱梯度洗脱，电喷雾串联质谱多反应监测模式对小鼠肺、肝、脾组织中的花生四烯酸类物质进行了分析。2实验部分2．1仪器与试剂1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；ABIQ-trap质谱仪(美国AppliedBiosystem公司)；2009—12-27收稿；2010-04-06接受本文由阁家自然科学基金(Nos．20835006．20675082，20805045)资助·E—mail：shixianz}le@dicp．ae．cn万方数据1090分析化学第38卷WiggensD．130匀浆器(德国Wiggens公司)；JY92一IIN超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；D．37520低温高速离心机(德国Kendro公司)；Labconco4．5L台式冷冻干燥机(美国Labconco公司)。甲醇、乙腈、甲酸(色谱纯，美国TEDIA公司)；乙酸乙酯(色谱纯，天津科密欧公司)；2，6一二叔丁基对甲酚(BHT，美国Sigma-Aldrich公司)；花生四烯酸类标准品(美国Cayman公司)。实验用水均由MilliQ超纯水器(美国Millipore公司)制得。2．2实验方法．2．2．1标准溶液的配制配制系列浓度的14，15一EET，11，12一EET，8，9-EET，5，6一EET，14，15一DHET，11，12一DHET，8，9-DHET，5，6一DHET，8-HETE，11一HETE，15一HETE，16一HETE，PGE2，PGD2，PGJ2，TXB：，15一deoxy—A12．14_pGj：，PGF：。，AA混合标准溶液，并加入内标，定容，使各内标最终浓度为15一HETE—d8(1...