收稿日期:2007Ο05Ο253基金项目:湖北省科技攻关项目(2004AA202B01)33通讯作者。Tel:86-27-87282608;Fax:86-27-87282608;Email:hzauvet@public.wh.hb.cn作者简介:何雁南(19812),女(汉族),湖北恩施人,博士研究生,研究方向为病毒分子生物学。E2mail:heyannanyaya@126.com检测猪瘟抗体间接ELISA方法的建立及应用3何雁南栾后利董晓辉曹毅姚清侠刘正飞陈焕春33(华中农业大学动物医学院传染病学研究室,武汉430070)摘要用猪肾传代细胞PK215增殖猪瘟病毒(CSFV)兔化弱毒苗株(HCLV),病毒培养上清液经硫酸铵沉淀、浓缩后作为包被抗原。经各种条件的优化,建立了检测猪瘟血清抗体的间接ELISA。所建立的间接ELISA抗原最佳包被浓度分22.28mg/L,血清最佳稀释度为1:40,与猪细小病毒、O型口蹄疫、猪衣原体阳性血清呈阴性反应,与HCV标准阳性血清、免疫猪血清和临床发病猪血清呈明显的阳性反应;与标准阴性血清和临床未感染CSFV的猪血清呈阴性反应;用HI和本ELISA方法检测94个猪厂送检血清1455份。其中血清稀释液中不含PEG6000的914份送检血清阳性率为83.7%,与HI符合率为96.6%,HI阳性率略高为85.7%;血清稀释液中含2%PEG6000的541份送检血清阳性率为88.72%,与HI符合率为97.3%,HI阳性率为88.17%。结果表明本试验所建立的间接ELISA具有敏感性高、特异性强、重复性好的优点,可用于临床猪瘟血清抗体的定性和定量检测。关键词猪瘟;ELISA;PEG2ELISA;间接血凝抑制试验猪瘟是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种猪的高度接触性传染病,病死率高,传播迅速,蔓延地区广,对养猪业构成了极大威胁。本病自1833年在美国首先被发现[1],迄今仍在世界上大多数养猪国家和地区有不同程度的发生与流行。在我国由于猪瘟兔化弱毒疫苗的大范围应用,急性猪瘟的发生虽然已大大减少,而温和性或称“非典型猪瘟”增多[2]。非典型猪瘟以高温稽留为主要特征,怀孕母猪多发生繁殖障碍,其他临床症状不明显,因此仅凭临床症状和病理剖检很难确诊,必须借助于如病毒分离,血清学诊断等方法。目前国内普遍使用的血清学方法是间接血凝抑制试验,但该方法存在主观性强,对判定结果的解释难以标化,不适合大批量检测等缺点。自1975年Voller等首先报道了ELISA方法以来[3],ELISA技术已普遍应用于传染病的流行病学普查和诊断。它具有灵敏度高,特异性强,适合大批量检测等优点,是进行疾病诊断和免疫监测的重要工具。而国外研制的ELISA试剂盒存在费用高,保存期短等问题。本试验用纯化的猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株(HCLV)作为抗原包被ELISA板,成功地建立了检测猪瘟病毒抗体的间接ELISA方法,并对临床送检血清进行了检测。现将报道如下。1材料与方法1.1材料(1)血清样品猪瘟、猪乙型脑炎、猪细小病毒病、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病、猪圆环病毒病阳性血清由本室提供。衣原体阳性血清,猪瘟标准阴阳性血清均购自中国农科院兰州兽医研究所。待检血清由湖北省、湖南省、山西省、河南省、安徽省、福建省、山东省、江西省、河北省等地区的94个猪场提供的送检猪血清。(2)病毒和细胞猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)由中牧实业有限·5·养殖与饲料2007年第7期试验研究公司惠赠,猪传代肾细胞系PK215购自武汉大学典藏物保中心。(3)主要试剂包被液,洗涤液,封闭液,酶标二抗与底物终止液均由本室研制。PEG6000购自SIGMA公司。(4)抗原的制备PK215细胞长满单层后倒掉细胞生长液,接种HCLV病毒液,37℃吸附1h后加入维持液,置3℃恒温箱内继续培养48h后收毒,冻融3次,4℃,5500rpm离心10min。取上清液,加入(NH4)2SO4至终浓度为42.5%～45%,沉淀病毒,磁力搅拌器搅拌过夜。4℃,6000rpm离心30min,弃上清,沉淀用少量生理盐水溶解,装透析袋用生理盐水透析,直至检测不出NH4+和SO422为止。-20℃保存,作ELISA抗原待用。1.2方法(1)ELISA最佳反应条件的确定使用方阵滴定的方法确定抗原(HCLV)的最佳包被浓度和待检猪血清的最佳稀释度。并选择含有不同PEG6000浓度(0～9%)的血清稀释液,同时确定最佳反应程序。(2)ELISA阴阳性界限的确定取84份间接血凝(HI)检测为CSFV抗体阴性的猪血清,按血清最佳稀释倍数稀释后进行间接ELISA试验,测定OD630nm值,确定以84份血清OD630nm值的平均值(X)加上2倍标准差(XD)作为判定阴阳性的界限...
