http://www.paper.edu.cn-1-基质金属蛋白酶及其组织特异性抑制物与环氧合酶-2在骨性关节炎中表达及临床生物学意义闫堃1，纪宗正1，王民21西安交通大学医学院第二附属医院普外科，西安（710004）2西安交通大学医学院第一附属医院骨科，西安（710061）E-mail：topestyk@163.com摘要：目的：观察COX-2、MMP-3和TIMP-1在骨性关节炎中的表达，探讨其与OA的发生、发展的关系。方法：采用HE染色及免疫组化法，检测OA组及正常对照组关节软骨组织切片中COX-2、MMP-3和TIMP-1蛋白的表达情况，应用统计学方法对其在OA的发生、发展中与OA病理分级、临床影像学分级的相关性进行非参数分析。并运用Spearman相关分析检验对OA组中MMP-3蛋白与COX-2蛋白的表达进行相关性分析。结果：骨性关关节炎组中MMP-3、TIMP-1、COX-2蛋白的阳性表达率分别为78.0%，68.7%和86.7%，与它们在正常软骨组织中的表比较有显着性差异（p<0.05），MMP-3、COX-2与关节损伤程度成正相关（p<0.05），TIMP-1与关节损伤程度成负相关（p<0.05）。。结论：OA中MMP-3的变化与COX-2变化无相关性。关键词：骨性关节炎；基质金属蛋白酶3；组织特异性抑制物-1；环氧合酶-2；免疫组化S-P法；细胞外基质骨性关节炎(osteoarthritis,OA)是以关节软骨进行性损害为特征的慢性关节紊乱综合征,是常见的运动系统疾病[1]。其病理变化包括：软骨退变、软骨下骨硬化及囊性变形成、关节边缘骨质增生以及滑膜慢性炎症等。目前，多数学者倾向认为骨关节炎疾病的发生发展是全身性易感因素参与下局部因素的作用[2]。OA发病过程中，滑膜成纤维细胞及其它相关的细胞既可通过分泌金属基质蛋白酶(MatrixMetalloproteinasesMMPs)等参与关节病变的慢性降解病理过程[3],也可通过释放各种炎性因子如前列腺素E2(PGE2)等影响关节炎性病变进程。环氧合酶-2(Cyclooxygenase2,COX-2)是前列腺素生物合成过程中的一个重要限速酶,其通过介导炎症因子释放和血管生成,从而加速关节炎性病变。特异性环氧合酶-2抑制剂的发现曾为揭示骨关节炎的发病机制及彻底征服该类疾患点亮希望，但随着FDA公布关于COX-2特异性抑制剂心血管风险事件的报告后2004年10月默克公司宣布从中国市场全面撤回万络（Vioxx,罗非昔布）使广大学者再度重新审视骨关节炎的病理生理机制[4]，倡导应用具有“双改性”（同时改善症状改良结构）的治疗方法。1.材料与方法1.1标本来源及临床资料选取西安交通大学医学院第一附属医院1999年1月至2004年1月经关节镜及手术切取的300例骨性关节炎病例，去除资料不全病例及合并其它疾病的病例取150例用于本研究。其中男85例，女65例，男女子比为1.31：1；年龄34-73（平均56.5±11.7）岁。1.2免疫组化染色石蜡标本4um连续切片，干燥箱，冷却,脱蜡，逐级脱水，洗涤后，抗原修复（具体参照试剂盒说明）。过氧化物酶阻断液,室温下孵育。PBS液冲洗，加去免疫性动物血清，室温下孵育。甩去血清，分别加COX-2一抗，MMP-3一抗，TIMP-1一抗，置湿盒中室温下http://www.paper.edu.cn-2-孵育。加生物素标记的二抗，室温下孵育，加链酶菌抗生物素—过氧化物酶溶液，室温下孵育。加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下观察显色。清水冲洗，苏木素复染。酒精梯度脱水干燥二甲苯透明。中性树胶封片。显微镜下观察。1.3HE染色常规HE染色。1.4质量控制染色设对照，以作为染色质量控制标准，阳性对照采用购于迈新生物技术开发有限公司的阳性对照片，空白对照采用PBS代替一抗，所有对照均与实验标本在相同条件下严格按照推荐方法进行染色。1.5结果判定标准免疫组化阳性反应为细胞浆或细胞核中有黄色颗粒。蛋白积累的评分方法：参照Fromwitz综合计分法行半定量分析，在高倍镜（400×）下，随机选择5~10个不同的视野各计数10~20个软骨细胞，共200个软骨细胞左右，记录阳性细胞的百分数和染色特征。阳性细胞的百分数计算公式：阳性细胞百分数=（阳性细胞/总细胞数）×100%。阳性百分率5~25%为1分、26~50%为2分、51~75%为3分、＞75%为4分。着色强度为多数阳性细胞呈现的染色计分，浅棕色为1分、棕色为2分、深棕色为3分。行综合评分，0~1分为阴性(－)，2~3分为弱阳性(+)，4~5分为中度阳性(++)，6~7...
