几种方法纯化小鼠腹水IgG2b类单抗的比较VIP免费

·48·AnimalHusbandry&VeterinaryMedicine2011Vo1．43No．1几种方法纯化小鼠腹水IgG2b类单抗的比较杨威，李小兵，刘国文，王哲，孔涛，张赕，刘磊，唐佳佳，李东娜，陈灰(吉林大学畜牧兽医学院，吉林长春130062)摘要：分别采用硫酸铵．蛋白A亲和层析法、改进后的硫酸铵．蛋白A亲和层析法、辛酸．硫酸铵．蛋白A亲和层析法纯化小鼠腹水IgG2b类抗体。经SDS-PAGE和间接ELISA分析纯化产物的纯度及其活性。结果表明：3种方法纯化后的单抗的免疫活性均未降低；纯化后单抗的亚类为IgG2b；经改进后的硫酸铵一蛋白A亲和层析法纯化制备的IgG2b类抗体纯度可达到87．1％；经辛酸一硫酸铵一蛋白A亲和层析法纯化制备的IgG2b类单克隆抗体纯度可达到100％，是一种制备高纯度小鼠腹水IgG2b类单克隆抗体简便而有效的方法。关键词：单克隆抗体；IgG2b；蛋白A亲和层析中图分类号：s859．87文献标识码：A文章编号：0529513o(2011)O1—0048—03蛋白A是金黄色葡萄球菌表面蛋白，能与不同种属、不同亚类的IgG抗体结合¨j，蛋白A亲和层析法是纯化小鼠腹水IgG类抗体简便而又高效的方法，具有高载量，高通透性，良好的稳定性，能有效地提高生产率，减少产物降解。本试验采用多种蛋白A亲和层析法纯化小鼠腹水IgG2b类单克隆抗体，以期纯化出高纯度的IgG2b类单克隆抗体。1材料与方法1．1试验材料分泌型为IgG2b类鼠抗相思子毒素杂交瘤细胞株由本实验室保存，常规方法制备腹水，HiTraprPro—teinAFF预装柱为AmershamPhamacia公司产品，蛋白检测试剂盒(BCAProteinAssayKit)为美国Pierce公司产品，小鼠亚类鉴定试剂盒为Sigma公司产品，电泳槽为美国BIO．RAD公司产品，酶联免疫检测仪收稿日期：2010-08—02基金项目：国家高技术研究发展计划(863计划)(2007AA10Z426，2007AA10Z440)。作者简介：杨威(1985一)，男，硕士研究生。通讯作者：王哲，教授，研究方向：动物营养代谢病与中毒病，E·mail：wangzhe500518@sohu．Corn。为美国BIO—RAD550型，其他试剂均为进口分装或国产分析纯化学试剂，试验用水为超纯水或去离子水。1．2腹水的处理方法采用二氧化硅吸附法对腹水进行初步处理。取一定量样品，加等量巴比妥缓冲液(VBS，pH7．2)稀释，加适量二氧化硅粉末(150me,／10mL稀释液)，室温搅拌30min，2000g离心20min，吸取上清备用。1．3辛酸一硫酸铵法纯化相思子毒素单抗取20mL二氧化硅吸附法处理过的腹水，用4倍体积的醋酸钠缓冲液(0．06moL／L，pH4．0)稀释腹水，并用0．1mol／L的氢氧化钠调混合液pH至4．5。将辛酸逐滴缓慢加入样品中，边加边搅拌，以每毫升原腹水滴加25辛酸计算。加完后继续搅拌3Orain，5000g离心30rain，取上清按体积比10：1与lO倍PBS混合，用0．1mol／L的氢氧化钠调pH至7．4。加入硫酸铵(每毫升混合液加入硫酸铵0．227g)，搅拌30rain后，10000g离心15min，弃上清，将沉淀溶于5mLPB(0．02mol／L，pH7．0)溶液中，于4℃条件下，对1000倍体积的PB透析，提纯样品于一20℃保存。内有关报道相一致。参考文献：[1][2][3][4]NY／T825-2004瘦肉型猪胴体性状测定技术规范[s]．NY—T821-2004猪肌肉品质测定技术规范[s]．张伟力．猪肉质地与风味测定[J]．养猪，2002，(4)：33_35．武英，郭建风，呼红梅，等．饲粮同时添加甜菜碱和维生素5][6][7]E对猪生长表现及胴体品质的影响[J]．养猪，2006，(5)：33—34．王昕陟，刘家胜．甜菜碱对肥育猪生长性能及胴体品质的影响[J]．养猪，2006，(1)：37-38．李明元，徐坤，马螈．饲粮添加茶多酚对猪生产性能和肉质的影响[J]．西南大学学报(自然科学版)，2007，29(8)：95-97．蔡海莹，朱建和，张伟力．茶多酚和维生素E对肥育猪肉品质的影响[J]．中国畜牧杂志，2008，(3)：43—45．畜牧与兽医2011年第43卷第1期1．4硫酸铵．蛋白A亲和层析法纯化相思子毒素单抗取20mL二氧化硅吸附法处理过的腹水，在冰浴中将处理好的腹水用PBS(0．02mol／L，含3mol／LNaC1，pH7．0)稀释4倍。逐滴缓慢加入相当于腹水8倍量的饱和硫酸铵，静置2h后，4cI=，10000g离心15rain，弃上清，将沉淀溶于PBS(0．02mot／L，含3mol／LNaC1，pH7．0)溶液，于4条件下，对1000倍体积的PBS(0．02mol／L，含3mol／L...