间接ELISA检测猪伪狂犬病血清抗体VIP免费

中国兽医学报2002年3月第22卷第2期ChinJVetSciMar．2002Vo1．22No～1间接ELISA检测猪伪狂犬病血清抗体邱德新．陈焕春，何启盖．吴斌．曹胜波(华中农业大学畜牧兽医学院．湖北武汉430070)摘要：用特肾传代细胞IBRS一8增殖猪伪狂犬茹藉毒(PRV)鄂A群，藉毒培养上清液经硅酸接沉淀、聚乙二醇(Mr20000)襄缩后作为包被抗原。用地化的猪血清1gG克疫家鬼，HRP标记提取的免抗猪1gG．制备出高效价的酶标抗体，酶标抗体工作暾度为15O000；经吝种条件的选择．建立丁捡刹猪伪征犬病血清抗体的间接EI1SA。所建立的闻接ELISA抗原包被浓度为39．2mg／'L，血清最佳稀释度为l20，与猪细小藉毒、猪瘟、o型口蹄症、猪表原津标准阳性血清呈阴性反应，与标准用性血清和：临床未感染PRV的猪血清呈阴性反应；与猪伪狂犬茹持隹性血清、免瘟猪血清和临床发藉猪血清呈明显的阳性反应；与羲国进口的PRV抗体检刹E11sA诊断试剂盒拴删结果比较．d5静楮血清的阴、阳性捡出井争率均为100。丧明建立的间接EI1SA具有敏感性高、特异性强、重复性好的优点可用于猪伪征犬病血清抗体的定性和定量检测。关t词：猪伪狂犬病；间接ELlSA；抗津检测中围分类号$854．4文献标识码：A文章编号l005—4545(2002)020149—04目前，用于猪伪狂犬病诊断的方；击，床上应用最广泛的是血清学诊断技术，除血清中和试验(SNT)、琼脂免疫扩散试验(AGID)、血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)外．本研究室已成功地建立了乳胶凝集试验(LAT)用于现场检测PRV抗体在此基础上，为能建立一种更敏感、特异，且重复性好，便于大规模血清学调查及免疫监测的血清学方法，特进行了本研究。1材料与方法1．1细胞与培养基1BRS·2细胞，由本室传代保存，用于增殖病毒；DMEM培养基，购自G1BCO公司1．2病毒与血清猪伪狂犬病病毒(PRV)鄂A株，本室分离鉴定保存PRV鄂A株阳性血清．由本室自制保存；猪伪狂犬病标准j丑性血清，中国兽药监察所和略尔滨兽医研究所惠赠；待检血清．采自省内外某些猪场已发病的猪和基层送检的猪血清；猪F1蹄疫标准阳性血清(O型)、猪瘟标准阳性血清，兰州兽医研究所惠赠；猪细小病毒标准阳性血清、猪衣原体标准阳性血清，购自湖北省畜牧普压研究所；猪伪狂犬病阴性【血清，选自从未发生过伪狂犬病猪场的2月龄健康仔猪，并经徽量中和试验检刹其PRV抗体为阴性。”13主要试剂和器材HRP，RZ一3．0，上海伯奥生物技术公司产品，批号941202；过碘酸钠(NalO)，北京化工厂生产．批号830110；牛血清白蛋白(BSA)，购自武汉亚法生物技术拓展公司；葡聚糖凝胶G一200(SephadexG一200)．上海化学试荆厂(Pharmada进口分装)PRV抗体检测试剂盒，购自美国IDEXX实验室96孔酶标板，浙江省玉环县康佳医化器械厂生产；DG一3022酶联免疫检测仪．华东电子管厂生产1．4主要溶液的配制(1)包被液(O．05mol／L．pH9．6碳醢盐缓冲液)：无水NaCO1．59g，NaHCO2．93g，蒸馏水溶解后定容至1000mL。(2)洗涤液(pH7．4PKST)；NaCI80g，KC[0．2g，KHaPO0．2g，Na2HPO{，l2H?O2．9g，吐温一200．5ral，蒸馏水溶解后再定容至l0o0mL。(3)封闭液：取1．0g牛血清白蛋白溶于100mI洗涤液。(4)磷酸盐柠檬酸缓冲液(pH5．0)：柠檬酸19．2g．NaHPO·12H2O71．6g，用蒸馏收稿日期：2000一】2-】8作者掩介：邱德赫(1967~)．男t讲师，博士水溶解后定容至1000mI。(5)底物藩液：邻苯二胺(OPD)蚰mg，溶于100mL磷酸盐一柠檬酸缓冲液中．加30H0：150p．1(现配现用)。(6)终止液2mo[几H}^溶液。1．8实验动4钉体重2～3kg的健康成年家兔，由华中农业大学实验动物场提供。1．6PRV抗原的制备用DMEM培养基(禽10犊牛血清)培养IBRS-2细胞，长成单层后倒掉营养液，按病毒与培养基110的比倒接种PRV鄂A株病毒．37C吸附1h，加入古3犊牛血清的DMEM维持液，置37C继续培养当7细胞产生病变时收毒，20C冻融3攻，6000r2'1]][i14C离心30min，去沉淀，按每100mI．上清液加42．5g(NH)}SO{沉淀病毒，磁力搅拌器搅捧过夜，6000re"m~n4C离心30rain．弃上清，沉淀用少量生理盐水溶解，装透析袋用生理盐水透析除盐直至检测不出NH；和so{一为止。以聚乙二醇(Mr20000)浓缩病毒液．用紫外分光光度计测定蛋白质含量后分装，置一7OC冻存对束感...