琼脂糖凝胶电泳检测DNAVIP免费

实验10琼脂糖凝胶电泳检测DNA一、实验原理DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双涟DNA几乎具有等量净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。一、实验原理具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。二、实验仪器1．恒温培养箱2．琼脂糖凝胶电泳系统3．台式离心机4．高压灭菌锅5．紫外线透射仪6．凝胶成像系统三、实验试剂１．Loadingdye(0.25%溴酚兰+40%蔗糖水溶液)10ml需0.025g溴酚兰和4g蔗糖２．ＥB：需1g溴化乙锭３．TBE：５×TBE贮液2L：108gTris-base、55g硼酸、40ml0.5M的EDTA(pH8.0)需7.4gdisodium·2H2O４．琼脂糖：30g四、实验步骤1．用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上；2．调整好梳子的高度；3．称取0.24g琼脂糖于30ml0.5×TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至45-50ºC时倒入制胶板中；4．凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带；四、实验步骤5．将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中；DNA5µl+ddH2O3µl+溴酚蓝2µl共10µl于0.5mltube中混合后点样；6．将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动；7．电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5µg/ml的溴化乙锭（EB）溶液中染色10－15min，清水漂洗后置于紫外透射仪上观察电泳结果，并照相记录。五、主要事项1．影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素：a．DNA分子大小迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子大小相等，电荷基本相等（DNA结构重复性）。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快（超螺旋>线性DNA）b．琼脂糖浓度：logU=logU0Kr胶浓度，U为迁移率，U0为DNA的自由电泳迁移率，为胶浓度，Kr为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNAAgarose：0.5%：1-30kb；0.7%：0.8-12kb1.2%：0.4-7kb；1.5%：0.2-3kb五、主要事项c．DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环。当条件变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。d．所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm五、主要事项e．碱基组成与温度：一般影响不大4-30℃f．嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率，(不提倡加在电泳液中)g．电泳缓冲液（0.5×TBE）的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTApH8.0）。五、主要事项2．溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。3．电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenolblue,Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylenecyanol,Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。六、思考题1、DNA在电场中的迁移率取决于哪些因素？2、琼脂糖凝胶有哪些注意事项？