第32卷第2期Vol.32No.2南华大学学报·医学版JournalofNanhuaUniversity(MedicalEdition)2004年4月Apr.2004石蜡切片厚度对流式细胞仪检测细胞周期分析的影响唐国华,龙治峰,贺修胜,唐朝克,何淑雅,唐新民(南华大学科研试验中心,湖南衡阳421001)摘要:目的探讨石蜡包埋组织制备单细胞悬液过程中,切片厚度对流式细胞仪检测结果的影响。方法以小型猪的肠系膜淋巴结为实验对象,将淋巴结分别制成新鲜组织单细胞悬液和石蜡组织块;石蜡组织块切割成不同厚度的薄片,再制成单细胞悬液;流式细胞仪分别检测其DNA含量;采用MultiCycleforWindows分析软件分析它们之间的差异。结果新鲜组织的G0/G1期、S期、G2/M期细胞所占比例、G0/G1峰的CV值及Debris值与石蜡组织之间存在差异;而不同厚度石蜡切片组织间制备的样本所测结果亦不相同。结论不同厚度石蜡切片组织制备的细胞悬液,对流式细胞仪检测细胞周期分析的结果有影响;以采用60μm厚的切片组织制备细胞悬液为最佳。关键词:流式细胞仪;DNA;石蜡切片中图分类号:R730.43文献标识码:A文章编号:1672-7444(2004)02-0226-04基金项目:湖南省自然基金资助项目(批号03Jjy3029).通讯作者:贺修胜,博士后,南华大学病理解剖学副教授,联系电话:0734-8281510.Email:tgh1@163.com.在肿瘤研究中,应用流式细胞仪技术分析肿瘤细胞的DNA含量及周期细胞群体数目,已成为肿瘤临床诊断、疗效评价及预后推测的重要参考依据1,2。DNA双螺旋结构碱基对与某些核酸荧光染料有良好的亲和力,在激发光的激发下,产生特定的荧光,运用流式细胞仪检测并分析这些荧光强度,从而了解细胞群体中各周期的分布状况,即G0/G1期、S期、G2/M细胞所占的百分比例。检测细胞周期状态的标本,可以是培养细胞、实体组织细胞及体液中收集的细胞;亦可以是新鲜组织,冰冻组织及石蜡包埋组织。尤其是石蜡包埋组织,已成为利用流式细胞仪进行回顾性与追踪性研究的材料。然而在利用石蜡包埋组织进行细胞周期分析时,其结果与新鲜组织比较,主要受到细胞碎片(Debris)的影响3,4。Rabinovich认为这可能是石蜡包埋组织在制备单细胞悬液时,切片切面的部分细胞被切割,经消化酶消化后,被切割的细胞将变成细胞碎片。为探讨石蜡包埋组织制备单细胞悬液过程对流式细胞仪检测结果的影响,本研究采用不同厚度切片组织与新鲜组织进行对比研究。1材料与方法1.1材料与仪器肠系膜淋巴结取材于10只小型猪,将同一淋巴结切割成大、小2块。大块组织经梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋;小块组织立即制备细胞悬液。碘化丙啶(PI)、RNAse、磷酸盐缓冲液、胃蛋白酶、TritonX-100、酒精、盐酸(1mol/L)、切片机(德国产)、恒温水箱、电冰箱、振荡器、离心机、酸度计、分析天平、过滤网、流式细胞仪(美国产AltraHypersortSystem)。1.2单细胞悬液的制备1.2.1石蜡包埋组织的单细胞悬液制备石蜡包埋组织,用切片机进行连续切片,其切片厚度分别为80μm、60μm、40μm、20μm,将组织切片成制备1×106个单细胞悬液。其步骤如下:将切片分别置入4只试管,加入8mL二甲苯室温脱蜡,24h、5h,弃二甲苯;依次加入100%、95%、70%、50%的梯度酒精5mL洗去二甲苯至水,每步间隔10min,弃酒精;加入蒸馏水5mL,洗涤10min;弃蒸馏水,加入2mL0.5%的胃蛋白酶(pH1.5～2.6220)消化液,置37℃恒温水箱中轻轻震荡,水浴消化5～10min;消化完毕,加入生理盐水终止消化,以300目尼龙网过滤、1500rpm离心,5min;生理盐水漂洗,500rpm,10min离心2次。对未消化完全的组织块进行二次消化。1.2.2新鲜淋巴组织单细胞悬液的制备2～4mm3组织,加入2mL0.5%的胃蛋白酶(pH1.5～2.0)消化液。其余步骤同上。1.3染色1.3.1染液配制PI0.2mg、枸橼酸钠100mg、NaCl156mg,TritonX-1001.0%,RNAse1μg/mL,蒸馏水100mL,配制成20μg/mLPI的去污染液。1.3.2细胞染色用PBS将细胞悬浮浓度调至1×106个/mL,取细胞悬液2mL,1500rpm离心,弃上清液,混匀,加入浓度为20μg/mLPI去污染液2.0mL,轻轻摇动,避光20min,上机。1.4仪器调试与参数的设定(1)检测标准荧光微球的CV值,调试仪器,CV值应≤2%。(2)采用线性放大,以标准荧光微球检查放大器的线性度。(3)直方图标记荧光道数的值为512。G0/G1峰荧光道数为100以上,通过调节PMT(光电倍增...
