野外水样的DNA提取方法VIP免费

野外水样的DNA提取方法1、用于检测mcyE基因表达的芯片与定量PCR的研究《DevelopmentofaChipAssayandQuantitativePCRforDetectingMicrocystinSynthetaseEGeneExpression》MATERIALSANDMETHODS：从无菌的产肝毒素Anabaenasp.90andMicrocystisaeruginosaPCC7806提取DNA和RNA。藻种在Z8培养基中培养21天，25°C，5-6μmolm-2s-1不连续光照，采用5μm孔径的聚碳树脂滤器收集细胞。此外，为使qPCR最优化，从15株Microcystis,13株Anabaena,2株Planktothrix,2株Nostoc,及2株Nodularia提取DNA备用。2006年6月至9月从Tuusulanja¨rvi湖采集5个水样。用带槽样板从0-2米深处采集100-250ml复合水样，并用5μm及1μm孔径的聚碳树脂过滤收集。对样品的DNA、RNA及微囊藻毒素进行收集。用于RNA提取的水样在湖滨取样后立即过滤，原位冻存在液氮中。而用于DNA及微囊藻毒素提取的水样运输到实验室后再过滤。在提取前，用于DNA和微囊藻毒素提取的样品冻存在-20°C，用于RNA提取的样品冻存在-70°C。核酸提取及反转录：采用beadbeatingandthecetyltrimethylammoniumbromide(CTAB)法提取藻种及野外水样中的DNA（Kolmonen18）。根据GeneCleanTurbokit指南进行进一步纯化(Q-Biogene)。通过紫外分光光度计(Biophotometer;Eppendorf)测量提取的DNA含量及质量。RNA提取时，过滤器转换到FastPrepLysingmatrixEtubes(Q-Biogene)，细胞裂解于1mlPMR1溶液(MOBIOLaboratoriesInc.)中，用FastPrepFP120beadbeater(ThermoElectronCorporation)于5ms-1，搅拌40s。随后，用UltracleanPlantRNAkitMoBioLaboratories)分离RNA。对于环境中的RNA样品，将两个过滤器联合使用以增加总的RNA量。提取的RNA用DNaseI按说明书（Promega）处理两遍。处理后的RNA用苯酚-氯仿萃取，以使酶失活及去除，乙醇沉淀，用水稀释至终体积为50μl。采用NanoDrop-1000分光光度计测(NanodropTechnologies)量RNA的含量及质量。通过mcyEqPCR证实RNA样品中不含DNA。用5至15μl的RNA作为模版，iScriptcDNAsynthesiskit(Bio-Rad)为试剂盒将RNA反转录为cDNA。参考文献：Kolmonen,E.,K.Sivonen,J.Rapala,andK.Haukka.2004.DiversityofcyanobacteriaandheterotrophicbacteriaincyanobacterialbloomsinLakeJoutikas,Finland.Aquat.Microb.Ecol.36:201–211.备注：该文章对水样进行显微镜观察，以便将结果与芯片检测结果作对照2、《DiversityofcyanobacteriaandheterotrophicbacteriaincyanobacterialbloomsinLakeJoutikas,Finland.Aquat.Microb》MATERIALSANDMETHODS：2002年及2004年从几个不同的湖泊采集水样。采用铺平板法分离单细胞蓝藻，重复该步骤3次或3次以上。（Shirai，1989）采用两步分离法（Shirai,1991）分离无菌藻种。简要地说，就是通过将含藻细胞的液体以1：100稀释后，用漩涡混合器摇动生长中期的培养基，使群落分散开，用1.5ml的离心管取1ml该培养液于400×g，20℃离心20min。接着，8，000×g离心10min，用微量吸液管将处于表层的悬浮细胞（1μl）吸取后平铺到CB琼脂培养基中（0.4%的琼脂糖LO3，TakaraBio,Otsu,Japan）.M.aeruginosaK-139,其mcy基因结构已经鉴定，被用作mcy阳性克隆。藻类培养条件：30℃，35μmolm-2s-1白炽灯连续光照。DNA提取及操作：蓝藻细胞水浴超声10s（36KHz，200W）使气囊裂解，随后8000×g，3min离心收集。参照（Nishizawa，1999）方法，当细胞处指数生长期末期时提取蓝藻宏基因组DNA。用大肠杆菌DH5αMCR及JM109作为质粒重组载体，将其于37℃，2×YT琼脂培养基培养。下面工作所需的抗生素为：氨苄75μgml-1卡那霉素15μgml-1。克隆用的连接载体为Pgem-Teasyvector。DNA提取过程见（Sambrook，1989）。参考文献：Shirai，1989DevelopmentofasolidmediumforgrowthandisolationofaxenicMicrocystisstrains(Cyanobacteria）.AppL.Environ.Microbiol.,55,2569-2571.3、《微囊藻的分离纯化培养及产毒特性鉴定》初步分离预培养将采集藻样稀释至适当浓度,在显微镜下用毛细管挑取微囊藻细胞单藻落,放入装有10ml培养基的消毒过的小三角瓶中,进行预培养1～2周,得到微囊藻的预培养液。分离纯化取5ml预培养液于10ml离心管,3000r...