核酸提取常见试剂的作用原理VIP免费

核酸提取常见试剂的作用原理异硫氰酸胍强用力的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。胍盐是破坏蛋白质三维结构的离液剂，在通常使用的蛋白质变性剂中作用最强的是异硫氰酸胍，它们可以使多数蛋白质转换成一随机的卷曲状态。含有强力的阴离子和阳离子基团，它们可以形成较强的氢键。在还原剂存在的情况下，异硫氰酸胍可以断裂氢键，而去垢剂，如SDS存在的情况下，可以破坏疏水作用。盐酸胍、尿素盐酸胍是一个核酸酶的强抑制剂，它并不是一种足够强的变性剂，可以允许完整的RNA从富含RNase的组织中提取出来。4-8M可断裂氢键，有两种可能机制：1变性蛋白和盐酸胍、尿素优先结合，形成变性蛋白-变性剂复合物，当复合物被除去，从而引起N-D反应平衡向右移动，随着变性剂浓度增加，天然状态的蛋白不断转变为复合物，最终导致蛋白质完全变性；2盐酸胍、尿素对氨基酸的增溶作用，能形成氢键，当浓度高时，能破坏水的氢键结构，结果盐酸胍、尿素就称为非极性残基的较好溶剂，使蛋白质内部的疏水残基伸展和溶解性加强，盐酸胍、尿素引起的变性往往是不可逆的。高浓度尿素使蛋白质变性并抑制Rnase活性十二烷基肌氨酸钠使蛋白质解体变性1防止蛋白质或酶等（如辅酶A）分子中SH基团氧化成二硫键，2在某些酶反应过程中维持体系的还原环境。DTT，DDTE、巯基乙醇应用最广，谷胱甘肽也常应用，由于他是生物体内的还原剂，同时氧化后能被谷胱甘肽还原酶原位释放。DNA提取中，常使用巯基乙醇，维持缓冲液的还原环境，防止多酚类氧化，由于具有一定的毒性，浓度不应高于2%。B-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键（肽和蛋白质分子中的半胱氨酸残基中的键）。1还原蛋白质二硫键，使Rna酶变性2抑制酚类氧化，若氧化，核酸会变成灰黑色，苯酚的氧化产物苯醌等氧化物引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联3保护蛋白质的巯基蛋白质提取中需要巯基乙醇还原二硫键，使RNA酶失活化学变性剂SDS、尿素、盐酸胍能破坏疏水键、盐键、氢键、范德华力使蛋白质变性但不影响肽键和二硫键，不能使蛋白质彻底变性加上还原剂巯基乙醇或DTT，能还原二硫键，使RNA彻底变性DTT二硫苏糖醇刺激性气味要小很多，毒性也比巯基乙醇低很多。而且DTT比巯基乙醇的浓度低7倍时两者效果相近，但DTT价格略高一些。由于容易被空气氧化，因此DTT的稳定性较差；但冷冻保存或在惰性气体中处理能够延长它的使用寿命。由于质子化的硫的亲核性较低，随着pH值的降低，DTT的有效还原性也随之降低；DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理。抑制Rnase活性TCEP三（2-甲酰乙基）膦盐酸盐Trizol苯酚、异硫氰酸胍、8—羟基喹啉、价巯基乙醇等。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8—羟基喹啉、异硫氰酸胍、B-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。0.1%的8—羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。B-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。组织破碎，裂解细胞十二烷基硫酸钠阴离子去垢剂，高温（55-65°C）裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，形成SDS/蛋白质/多糖复合物，释放核酸，提高盐（KAc或NaAc）浓度并降低温度（冰浴），使SDS/蛋白质/复合物转变为溶解度更小的钾盐酸形式，使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全、离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀水相中的DNA操作简单，温和，可提取到高分子量的DNA，但产物多糖类杂质较多阳离子强表面活性剂，通常与蛋白酶K和抗氧化剂、螯合剂一起使用可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离溶解膜类蛋白SDS能裂解细胞。使细胞中的蛋白质和核酸之间常借着静电引力或配位键结合，阴离子去污剂能够破坏这种价键，使染色体离析，蛋白变性，释放核酸。(1)SDS是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白质的氢键和疏水键打...