D生化分离技术总结A.DDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD层析即色层分析也即色谱。主要是基于氨基酸的酸碱性质和极性大小口1.分配柱层析：层析柱中的填充物或称支持剂都是一些具有亲水性的不溶物质，如纤维素、淀粉、硅胶等。其实质就是流动相把各成分从固定相中连续提取出来,并向下移动，结果分配系数大的成分移动速度大，分配系数小的成分移动速度小,因而彼此分离。2•纸层析：以滤纸为载体用来代替层析柱，利用纸上吸附的水为固定相，与水不想混合的有机溶剂为流动相从纸上流过，达到液-液连续萃取的目的，使物质得到纯化或分离。3•离子交换层析：以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。4•薄层层析：快速分离和定性分析少量物质的一种重要实验技术，属固-液吸附色谱，兼备了柱色谱和纸色谱的优点，一方面适用于少量样品的分离，另一方面在制作薄层板时，把吸附层加厚加大，因此，可用来精制样品，适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。5•气液层析6•高效液相层析：高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测,从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。DDDDDDDDD1.DDDDDDDDDDD渗透压法测定相对分子质量沉降分析法测定相对分子质量凝胶过滤法测定相对分子质量法测定相对分子质量2.DDDDDDDD蛋白质混合物纯化方法性质方法规模离心大或小大小和休积凝胶过滤一般小的透析、超滤一般小的离子交换层析大或小电荷极性离子交换聚焦一般小的电泳一般小的等电聚焦一般小的疏水性质疏水层析一般小的PH值变化—般大的溶解度篱子强度变化一般小的介电常数变化一般大的亲和层折一般小的Diehgand层析大或小特殊结合位点或结构位点亲和洗脱大或小免疫吸附一般小的共价层析一般小的3.DDDDDD:DDDDDDDDDDDDDDDD,DDDDDDDD.盐析法（首推，不易引起蛋白质变性）向蛋白质溶液中加入大量的中性盐使其脱去水化层而聚集沉淀一般不引起蛋白质变性出去盐后可复溶有机溶剂沉淀法加入一定量的极性有机溶剂使其脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用致使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀重金属沉淀法当溶液大于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，易于与重金属结合成不溶性盐而沉淀。生物碱试剂和某些酸类沉淀法：如鞣酸（单宁酸）、苦味酸、钨酸等。加热变性沉淀法：几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。4.DDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDB.DDDD糖链的结构分析1.DD2.DD化学方法：（）高碘酸氧化（）甲基化分析（）寡糖顺序降解酶学方法：糖苷酶仪器测定方法：红外光谱、激光拉曼光谱、质谱、核磁共振，快速原子轰击，是一项测定寡糖乃至复杂糖一级结构的有用方法。C.DDDD.脂质的有机溶剂提取：非极性脂质（三酰甘油、蜡、色素）用乙醚、氯仿或苯等从组织中提取；膜脂（磷脂、糖脂、固醇）用极性有机溶剂如乙醇或甲醇提取。.脂质的色谱分离：高效液相色谱（）和薄层层析（），二者分辨率较高。分析：专一性水解及其产物的气液色谱（）或薄层层析（）相结合的技术常用来测定一个脂的结构。用质谱分析来确定烃链长度和双键的位置。D.DDDD㈠核酸的分离、提纯和定量测定1.DNA的分离核蛋白DNP=染色体DNA+组蛋白(1)破碎细胞-t浓盐溶液抽提一-0.14mol/L盐溶液使DNP沉淀有机溶剂法：氯仿和酚是蛋白质变性剂，使蛋白质沉淀而与核酸分开；①苯酚抽提，去蛋白，用乙瞇和乙醇沉淀得到纯DNA②用氯仿-辛醇(或异丙醇)抽提，方法同苯酚。离心后分为两相：上层水相含DNA,中层为蛋白质，下层有机相含变性蛋白质。⑵蛋白酶水解法：制备大分子DNA,比较温和，常用蛋白酶水解后苯酚提取细胞悬液2倍体积SDS(1%)——广谱蛋白酶降解蛋白质---f苯酚抽提去蛋白——*RNAas巳去除RNA2.RNA的分离(1)为防止RNA的降解要注意①器皿要经过特殊处理如高温、焦碳...
