亲和毛细管电泳技术及其应用VIP免费

文献综述亲和毛细管电泳技术及其应用王京兰钱小红（军事医学科学院国家生物医学分析中心北京100850）提要对近几年新发展起来的亲和毛细管电泳技术(ACE)的原理、分类及方法作了简要介绍，着重介绍了亲和毛细管区带电泳、毛细管亲和凝胶电泳、胶束电动色谱中的亲和电泳、亲和毛细管等电聚焦、亲和探针毛细管电泳等过程和方法。对ACE在分子生物学、生物化学中的应用及该技术在亲和常数测定、核酸片段识别、竞争免疫分析、药物先导化合物的筛选等方面的应用也作了介绍。关键词毛细管电泳，亲和毛细管电泳，蛋白质，核酸分类号O6581前言亲和毛细管电泳(affinitycapillaryelectro-phoresis,ACE)是指在电泳过程中具有生物专一性亲和力的两种分子受体(receptor)和其配体(ligand)间，发生了特异性相互作用，形成了受体－配体复合物，通过研究受体或配体在发生亲和作用前后的电泳谱图变化，可获得有关受体-配体亲和力大小、结构变化、作用产物等方面的信息。多种毛细管电泳模式中均可引入亲和机制。目前亲和毛细管电泳技术已用于研究各种类型的配体-受体相互作用，测定其亲和常数。通过改善被分析物的电泳迁移行为，可提高分离分辨率和分析灵敏度。本文仅就ACE的原理及其应用进展作一介绍。2各种ACE的原理及方法2.1以毛细管区带电泳为基础的ACE在毛细管区带电泳中，被分析物的电泳淌度μ与其质量m和所带电荷z有关:ocz/m2/3。在电泳缓冲液中加入被分析样品的带电亲和配体时，样品进入缓冲体系和配体发生一定程度的相互作用，改变了样品的质量和电荷，导致了电泳淌度的变化。根据样品在配体加入前后的迁移时间变化可判断样品与配体是否发生了亲和相互作用，并可估计亲和力的大小[1,2。这种方式适用于相互作用双方的结合力较弱、在电泳过程中不断进行着结合与解吸的过程。还可以将亲和配体化学键合到毛细管柱上，制成亲和毛细管柱。亲和毛细管柱增加了分离的选择性，与亲和配体作用力强的样品组分的出峰时间延长了[3]配体对受体淌度变化的影响，与配体的大小及带电量有关[1,2.4。小配体引起的变化小，带电量大的配体对受体淌度的影响大。配体浓度L]、配体-受体结合常数Kb对受体迁移时间有正性影响，它们的值越大，受体迁移时间的变化就越大。当配体浓度已达到与受体结合的饱和浓度时，再增加配体浓度，受体迁移时间也不会有很大的变化[4。对于分离配体和受体反应后的混合物，可通过改变反应时间和反应物浓度来观察配体、受体结合的中间过程。以区带电泳为基础的毛细管亲和电泳操作简单、方便，在测定生物分子相互作用的亲和常数方面有许多优点，如样品用量少，对样品纯度和准确浓度要求不高，可同时测定样品中多个成分与配体作用的亲和统常Ｊ数等测舛定亲缀和统常Ｊ数的般方法是用不同浓度的配体进行多次试验，根据配体浓度与样品迁移时间或淌度的关系方程来计算结合常数Kb或解吸常数Kd[2,4～7]。22毛细管亲缀和凝胶电缬泳(CapilaryAffinityGelElectrophoresis,CAGE)亲和凝胶毛细管电泳是将被分析物的亲和配体加尤入凝胶夯基质手中使二者发⑸生特匾异性相互プ作用改谋被分析物的迁移速度。亲和配体加入凝胶基质的方式有3种:(a)将配体加入凝胶缓冲液中，形成溶剂化配体，(b)将大配体嵌在凝胶网格中，(c)直接将配体化学Ъ键合于谀凝胶基质（图l）上8,9现以聚乙烯基腺嘌呤[poly(9-vinyladenine)，PVAd为大配体模型来说明CAGE中配体、受体的相互作用PVAd是以聚乙烯链代替糖磷酸骨架艿的聚核昔酸类似物，它能够与碱基互补的天然聚核昔酸通过氢键作用形成复合物。用嵌有PVAd大配体的凝胶毛细管可分离寡核昔酸dT和dA，dT与本文收稿日期:1998-04-25，修回日期:1998-10-17PVAd的碱基互补，迁移时间长，在无PVAd的凝胶毛细管中，二者迁移时间相同（图2）。随着凝胶中所含PVAd浓度的增加，dT的迁移时间也增加，但同时也伴随峰形的展宽[92.3胶束电动毛细管色谱(MicellarElectrokineticCapillaryChromatography,MECC)中的亲和电泳研究生物大分子（如蛋白）与其亲和配体的相互作用要在非变性环境中进行，在MECC中引入亲和机制要考虑去污剂对蛋白活性的影响。Ｏkun等10研究了MECC中生物素结合蛋白与生物素的结合...