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酵母双杂交操作步骤VIP免费

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(酵母菌储存在-70°C中,引物和质粒DNA储存在-20°C中)概念:1.次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中(常是DNA-BD/baitplasmid),在选择培养基中选择出阳性克隆,之后再将另外一个质粒(ADfusionlibrary)转化进去。优点:就是比共转化使用更少的质粒DNA,也就是节约质粒DNA。2.共同转化:将两种质粒一起转化进酵母中。优点:比次序转化更容易操作。pGBKT7的选择物是:kanamycin(卡那霉素)pGADT7的选择物是:ampicillin(氨苄西林)各种SD培养基:1)SD/-ade(腺嘌呤)/-leu(亮氨酸)/-trp(色氨酸)/-his(组氨酸)(1000ml)(“四缺”)酵母氮源(YNB:;-ade/-leu/-trp/-hisDOsupplement0.60g(购买来就配好的);葡萄糖20g(即2%)2)SD/-leu/-trp/-his(1000ml)酵母氮源(YNB):;-leu/-trp/-hisDOsupplement0.62g;(购买来就配好的)葡萄糖20g.(即2%)3)SD/-leu/-trp(1000ml)(“二缺”)酵母氮源(YNB):;-ade/-leu/-trp/-hisDOsupplement0.64g(购买来就配好的)葡萄糖20g(即2%)4)SD/-leu(1000ml)酵母氮源(YNB):;-leuDOsupplement0.69g;(购买来就配好的)葡萄糖20g(即2%)5)SD/-trp(1000ml)酵母氮源(YNB):;-ade/-leu/-trp/-hisDOsupplement0.74g;(购买来就配好的)葡萄糖20g(即2%)注意:YNB有两种,一种含有硫酸胺,另外一种不含硫酸胺。我们这用的是含硫酸铵的。(买来就加进去了的。如果不含硫酸铵,那么要在终浓度%的YNB中再加入%的硫酸铵,即最终在1000ml溶液中加入总量为的YNB与硫酸铵。实际配制的方法是:1.配制40%的葡萄糖贮存液(贮存在4°C),过滤除菌,待高压灭菌的溶液温度降至55°C以下时,再将50ml葡萄糖贮存液加入。(过滤即可使用)2.酵母氮源6.7g,加DOsupplement在920mI水中溶解,调PH至(大约加10MNaOH200ul即可),之后补水至950ml。3.高压完后待温度降至55°C以下,加入50mI40%葡萄糖。YPD培养基(1000ml)20g/L蛋白胨10g/L酵母提取物20g/L琼脂(只有制作平板才用)20g/L葡萄糖(即2%)1xYPDA培养基(1000ml)20g/L蛋白胨10g/L酵母提取物0.03g/L腺嘌呤(即终浓度为%)腺嘌呤可以耐受高温20g/L葡萄糖(即2%)实际配制的方法是:1.配制40%的葡萄糖贮存液(贮存在4°C),过滤除菌,待高压灭菌的溶液温度降至55°C以下时,再将50mI葡萄糖贮存液加入。(李博士经验这一步不高压,过滤即可使用)2.配制%的腺嘌呤溶液,过滤除菌,待高压灭菌的溶液温度降至55°C以下时,再将15ml腺嘌呤溶液加入。(或将腺嘌呤直接加进去,为了方便我将直接加进去一起高压)3.(蛋白胨20g;酵母提取物10g;水大约925ml)混合后,调至PH至,加水至935ml,121°C高压15min。注意:高压的温度和时间不能太长与太高,121°C高压15min即可。可以在YPDA中加入20g/L的琼脂,以配成平板。需要加kanamycin时,kan终浓度是10-15mg/L。(kanamycin可以20C贮存一个月,加入到平板中去可以4°C贮存一个月。)PEG/LiAc溶液(即配即用)用下列贮存液来配制50%PEG3350:用灭菌水配,如需要可以加热至50C以助溶。10XTEbuffer:用灭菌水配,如需要可以加热至50C以助溶。10XLiAc:用灭菌水配,如需要可以加热至50C以助溶。最后配成PEG/LiAc溶液是:(以10ml为例)终浓度为配制10mlPEG/LiAc需要加入的物质PEG400040%8mlof50%PEGTEbuffer1X1mlof10XTELiAc1X1mlof10XLiAc无菌1xTE/LiAc溶液(用10x已灭菌的贮存液稀释)10xTEbuffer:0.1MTris-HCl,10mMEDTA,pH(高压)10xLiAc:1M用稀醋酸调节PH至高压For(3-galactosidase滤膜实验Zbuffer溶液:NaHPO?7HO16.1g/L(如换NaHPO?14HO则20.739g/L)242242NaHPO4?HO5.50g/L(如换NaHPO4?2HO则6.21g/L)2222KCl0.75g/LMgSO?7HO0.246g/L42最后调PH至,高压,室温下可以贮存1年X-gal溶液:X-GAL溶解于DMF(二甲基甲酰胺)中至浓度为20mg/ml.,-20°C避光保存Zbuffer/X-gal溶液:100mlZbufferml3-mercaptoethanol(3-巯基乙醇)mlX-gal贮存液ONPG溶液(即配即用)ONPG溶于Zbuffer中,终浓度4mg/ml,调PH至.注意:1.ONPG需要1〜2h才能溶解2.每次用之前新鲜制备。带有3-巯基乙醇的zbuffer将ml巯基乙醇加入100mlZbuffer中即可为了转化成功的小提示...

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