酵母双杂交操作步骤VIP免费

（酵母菌储存在-70°C中，引物和质粒DNA储存在-20°C中）概念：1.次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/baitplasmid）,在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（ADfusionlibrary）转化进去。优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。2.共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。优点：比次序转化更容易操作。pGBKT7的选择物是：kanamycin（卡那霉素）pGADT7的选择物是：ampicillin（氨苄西林）各种SD培养基：1）SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his（组氨酸）（1000ml）（“四缺”）酵母氮源（YNB:;-ade/-leu/-trp/-hisDOsupplement0.60g（购买来就配好的）;葡萄糖20g（即2%）2）SD/-leu/-trp/-his（1000ml）酵母氮源（YNB）:;-leu/-trp/-hisDOsupplement0.62g;（购买来就配好的）葡萄糖20g.（即2%）3）SD/-leu/-trp（1000ml）（“二缺”）酵母氮源（YNB）:;-ade/-leu/-trp/-hisDOsupplement0.64g（购买来就配好的）葡萄糖20g（即2%）4）SD/-leu（1000ml）酵母氮源（YNB）:;-leuDOsupplement0.69g;（购买来就配好的）葡萄糖20g（即2%）5）SD/-trp（1000ml）酵母氮源（YNB）:;-ade/-leu/-trp/-hisDOsupplement0.74g;（购买来就配好的）葡萄糖20g（即2%）注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。我们这用的是含硫酸铵的。（买来就加进去了的。如果不含硫酸铵，那么要在终浓度%的YNB中再加入%的硫酸铵，即最终在1000ml溶液中加入总量为的YNB与硫酸铵。实际配制的方法是:1.配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4°C）,过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55°C以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。（过滤即可使用）2.酵母氮源6.7g,加DOsupplement在920mI水中溶解，调PH至（大约加10MNaOH200ul即可），之后补水至950ml。3.高压完后待温度降至55°C以下，加入50mI40%葡萄糖。YPD培养基(1000ml)20g/L蛋白胨10g/L酵母提取物20g/L琼脂（只有制作平板才用）20g/L葡萄糖（即2%）1xYPDA培养基(1000ml)20g/L蛋白胨10g/L酵母提取物0.03g/L腺嘌呤（即终浓度为％）腺嘌呤可以耐受高温20g/L葡萄糖（即2%）实际配制的方法是：1.配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4°C）,过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55°C以下时，再将50mI葡萄糖贮存液加入。（李博士经验这一步不高压，过滤即可使用）2.配制％的腺嘌呤溶液，过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55°C以下时，再将15ml腺嘌呤溶液加入。（或将腺嘌呤直接加进去，为了方便我将直接加进去一起高压）3.（蛋白胨20g；酵母提取物10g；水大约925ml）混合后，调至PH至，加水至935ml,121°C高压15min。注意：高压的温度和时间不能太长与太高，121°C高压15min即可。可以在YPDA中加入20g/L的琼脂，以配成平板。需要加kanamycin时,kan终浓度是10-15mg/L。（kanamycin可以20C贮存一个月，加入到平板中去可以4°C贮存一个月。）PEG/LiAc溶液（即配即用）用下列贮存液来配制50%PEG3350：用灭菌水配，如需要可以加热至50C以助溶。10XTEbuffer：用灭菌水配，如需要可以加热至50C以助溶。10XLiAc：用灭菌水配，如需要可以加热至50C以助溶。最后配成PEG/LiAc溶液是：（以10ml为例）终浓度为配制10mlPEG/LiAc需要加入的物质PEG400040%8mlof50%PEGTEbuffer1X1mlof10XTELiAc1X1mlof10XLiAc无菌1xTE/LiAc溶液（用10x已灭菌的贮存液稀释）10xTEbuffer:0.1MTris-HCl,10mMEDTA,pH（高压）10xLiAc:1M用稀醋酸调节PH至高压For（3-galactosidase滤膜实验Zbuffer溶液:NaHPO?7HO16.1g/L（如换NaHPO?14HO则20.739g/L）242242NaHPO4?HO5.50g/L（如换NaHPO4?2HO则6.21g/L）2222KCl0.75g/LMgSO?7HO0.246g/L42最后调PH至，高压，室温下可以贮存1年X-gal溶液：X-GAL溶解于DMF（二甲基甲酰胺）中至浓度为20mg/ml.,-20°C避光保存Zbuffer/X-gal溶液：100mlZbufferml3-mercaptoethanol（3-巯基乙醇）mlX-gal贮存液ONPG溶液（即配即用）ONPG溶于Zbuffer中，终浓度4mg/ml,调PH至.注意：1.ONPG需要1〜2h才能溶解2.每次用之前新鲜制备。带有3-巯基乙醇的zbuffer将ml巯基乙醇加入100mlZbuffer中即可为了转化成功的小提示...