质粒提取方法及步骤VIP免费

质粒提取方法及步骤碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术可是我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少追其原因，我想大概是因为分子克隆里面只讲实验操作步骤，而没有对原理进行详细的论述这是导致我的学生误入歧途的主要原因后来我发现其实是整个中国的相关领域的研究生水平都差不多，甚至有很多老师也是这个状态这就不得不让人感到悲哀了我想这恐怕和我们的文化有点关系中国人崇尚读书，学而优则仕的观念深入人心经常听到的是父母对他们的独苗说，你只要专心读好书就可以了所以这读书的定义就是将教课书上的东西记住，考试的时候能拿高分这就是现代科学没有在中国萌发的根本原因如果中国文化在这一点上不发生变化，那么科学是不能在中国真正扎根的，它只能蜕化成新的八股学生命科学是实验科学，它讲究动手如果实验科学只要看看书就可以了，那我想问有那位神仙看看书就会骑自行车了？或者听听体育老师的讲解就会滑冰了？可是光动手不思考，不就成了一个工匠？一个合格的生命科学研究者，需要在这两方面完善自己一个杰出的科学工作者，是一个熟知科学原理并善于应用的艺术家每个曾经用碱法抽提过质粒的同学，希望你看本文后能有所思考，让中国的未来有希望为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I,50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA,pH8.0；溶液II，0.2NNaOH/1%SDS；溶液III,3M醋酸钾/2M醋酸让我们先来看看溶液I的作用任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH,因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了那么50mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响所以说溶液I中葡萄糖是可缺的那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长在溶液I中加入高达10mM的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA如果哪天你手上正好缺了溶液I,可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块轮到溶液II了这是用新鲜的0.4N的NaOH和2%的SDS等体积混合后使用的要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致用了不新鲜的0.4NNaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组DNA也会断裂基因组DNA的断裂会带来麻烦，后面我再详细说明每个人都知道，溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀如果你这样怀疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变...