酶联免疫吸附实验汇总VIP免费

1ELISA简介随着方法的不断改进、材料的不断更新，尤其是采用基因工程方法制备包被抗原，采用针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断试验，大大提高了的特异性，由于电脑化程度极高的检测仪的使用，更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。被广泛应用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。在动物检疫方面，在猪传染性胃肠炎、牛副结核病、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病等的诊断中已为广泛采用的标准方法。基本原理方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使方法成为一种既特异又敏感的检测方法。特性用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。如今应用较多的2有辣根过氧化物酶（）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以应用最广。辣根过氧化物酶过氧化物酶（）广泛分布于植物中，辣根中含量最高，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（），是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量），分子量约，约由个氨基酸组成，等电点为，催化反应的最适值因供氢体不同而稍有差异，一般多在左右。此酶溶于水和饱和度以下的硫酸铵溶液。酶蛋白和辅基的最大吸收光谱分别为和。酶的纯度以表示：纯酶的多在以上，最高为。在以下的酶制品为粗酶，非酶蛋白约占，不能用于标记。在以上者方可用于标记。的作用底物为过氧化氢，催化反应时的供氢体有几种：（1）邻苯二胺（），产物为橙色，可溶性，敏感性高，最大吸收值在，可用肉眼观察判别，容易被浓硫酸终止反应，颜色可在数小时内不改变是目前国内中最常用的一种；⑵联大茴香胺（），产物为橘黄色，最大吸收值在,颜色较稳定；⑶一氨基水杨酸一）：产物为深棕色,最大吸收值在，部分溶解，敏感性较差；⑷邻联甲苯胺（）产物为蓝色，最大吸收值在，部分溶解，不稳定，不耐酸,但反应快，颜色明显。碱性磷酸酶系从小牛肠粘膜和大肠杆菌中提取，由多个同功酶组成。它们的底物种类很多，常用者为硝基苯磷酸盐，廉价无毒性。酶解产物呈黄色，可溶，最大吸收值在。酶的活性以在反应系统中，°C分钟水解卩磷酸苯二钠为一个单位。3标记方法良好的酶结合物取决于两个条件：即高效价的抗体和高活性的酶。抗体的活性和纯度对制备标记抗体至关重要，因为特异性免疫反应随抗体活性和纯度的增加而增强。在酶标记过程中，抗体的活性有所降低，故需要纯度高、效价高及抗原亲和力强的抗体球蛋白，最好使用亲和层析提纯的抗体，可提高敏感性，而且可稀释使用，减少非特异性吸附。酶与抗体交联，常用戊二醛法和过碘酸盐氧化法。郭春祥建立的标记抗体的改良过碘酸钠法简单易行，标记效果好，特别适用于实验室的小批量制备。其标记程序为：将卩溶于蒸馏水中，加入新鲜配制的的过碘酸钠（）水溶液，混匀置°冰箱分钟，取出加入的乙二醇水溶液，室温放置分钟后加入含纯化抗体的水溶液，混匀并装透析袋，以、的碳酸盐缓冲液于°冰箱中慢慢搅拌透析小时（或过夜）使之结合，然后吸出，加硼氢化钠（）溶液（，置°冰箱小时，将上述结合物混合液加入等体积饱和硫酸铵溶液，置°冰箱分钟后离心，将所得沉淀物溶于少许、中，并对之透析过夜（°C）,次日离心除去不溶物，即得到酶标抗体，用、稀至,进行测定后，冷冻干燥或低温保存。效果测定测定内容包括酶和抗体活性、结合物中酶含量和含量、酶与摩尔比值以及结合率。4⑴酶与抗体的活性常用琼脂扩散或免疫电泳法，使抗原与抗体形成沉淀线，经漂洗天，再以蒸馏水浸泡小时，将琼脂凝胶片浸于酶底物溶液中着色，如果出现应有的颜色反应，再用生理盐水浸泡，颜色仍然不褪，表...