蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测VIP专享VIP免费

蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测摘要随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究还是其他研究，越来越需要纯度更高的酶制剂，这就要求我们熟悉酶提纯的一般操作步骤及酶的提纯及活力测定等重要的生物实验技术。本次实验主要通过提取啤酒酵母中的蔗糖酶并经过两次纯化测定其活力与Km。在实验过程中用乙醇分级分离法，DEAE-Cellulos柱层析，分子筛（凝胶过滤）层析提取纯化蔗糖酶。在实验过程中，虽然我们很努力,但由于我们对实验的程序不熟悉，因此在实验的一些过程中有一些明显的操作失误，使得实验的最后测定结果与理论值有一定出入。关键词啤酒酵母蔗糖酶乙醇分级分离DEAE-Cellulose柱层析分子筛层析Km、八、•前言生物体内所发生的一切化学反应，几乎都是在专一性酶的催化下进行的，因此酶的研究对了解生命活动的规律以及生命本质的阐述具有十分重要的意义。随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究以及分子生物学其他重要课题的研究都越来越多地需要使用作用专一，纯度高的酶制剂。这就要求人们建立各种方法，以便从各种生物来源的材料中分离提纯酶。由于酶本身也是蛋白质，因此酶分离提存的方法大体上与蛋白质纯化方法相同，一般来说，没有一种固定的方法，而往往根据实验者所要分离提纯酶的取材以及酶本身的物理、化学及生物学性质来确定分离提纯方法。各种酶的纯化通常有五个阶段：①材料的选择与预处理；②细胞破碎；③抽提；④纯化；⑤浓缩、干燥及保存。酶分离纯化成功与否的重要标志：一是要有较高的收率；二是达到所要求的纯度，这两个指标通常是矛盾的，可根据需要来有所侧重，一般来说，好的方法与步骤应该是简单易行，最终的酶制剂有较高的收率和纯度。就单独的每种分离提纯的方法而言，有盐析法、有机溶剂分级法、调PH分级沉淀法、选择变性法、吸附法、层析法（纸层析、薄板层析、柱层析等）。其中盐析法是用于蛋白质和酶分离提纯的最早而且最广泛的一种方法，该方法是根据蛋白质和酶在一定浓度的溶液中溶解度的降低程度的不同而达到彼此分离的方法盐析法常用的中性盐有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等，其中用得最多的是硫酸铵，因为它具有温度系数小而溶解度大的优点。在一定的溶解度范围内许多蛋白质和酶均可盐析出来。其次，它的价格便宜，分级效果好且不容易引起蛋白质变性，在一定程度上还有稳定作用。有机溶剂沉淀法能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的斥力，导致溶解度的降低。另外，有机溶剂与水作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶液中便沉淀析出。在分离纯化的过程中，往往需要几种方法的合理结合，方法选择的好，前后串联得当，可大大提高整个分离提纯过程的速度和收效。在分离提纯过程中，应该尽量避免引起蛋白质变性的各种因素，此外，在分离提纯前，必须建立对酶的分析鉴定方法，以正确指导分离提纯地进行。材料与方法1.材料啤酒酵母（兰州黄河啤酒有限公司）2．方法及步骤2.1葡萄糖浓度标准曲线的制作：取22支编号的试管（两个平行）按下表的顺序加入0.2%Glc溶液，水及3,5-二硝基水杨酸试剂。然后在沸水浴中加热5分钟，然后立即用自来水冷却并用蒸馏水定容至25ml，摇匀，于540nm测光密度，结果如下表所示：管号含糖量（ug）BG溶液0.2%Glc标准液（ml）水（ml）3.5-二硝基水杨酸试剂（ml）OD540nm平均OD540nm10.00.02.01.50.00.00.020.40.21.81.50.0650.0730.06930.80.41.61.50.1530.1670.16041.20.61.41.50.2570.1850.22151.60.81.21.50.3460.3340.34062.01.01.01.50.4430.4290.43672.41.20.81.50.5080.5060.50782.81.40.61.50.5940.6020.59893.21.60.41.50.6690.6580.664103.61.80.21.50.7660.7530.760114.02.00.01.50.8500.8180.8342.2标准蛋白曲线的制作取11支编号的试管，分别准确加入如下表所示的牛血清白蛋白溶液，然后分别加入1.5ml考马斯亮蓝G-250蛋白染色试剂，摇匀，放置3min后，在595nm比色读取OD值，结果如下表所示：试管号012345678910标准蛋白浓度（ug/ml）020406080100120140160180200牛血清白蛋白标准液（ml）00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.0水（m...