DNA提取和常见问题分析及对策VIP免费

DNA提取和常见问题分析及对策主讲人：关锰生物秀-专心做生物www.bbioo.com生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.comDNA简单介绍DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。为了进行测序、杂交和基因的表达，获得高分子量和高纯度的DNA是非常重要的前提。生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物www.bbioo.comDDNNAA提提取取原则原则保证DNA结构的完整性纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质排除有机溶剂和金属离子的污染蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物www.bbioo.comDDNNAA提取的提取的几几种方法种方法一、染色体DNA的提取CTAB法SDS法其它bbs.bbioo.com生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区www.bbioo.com生物秀-专心做生物DDNANA提提取取的几的几种种方法方法二、非染色体DNA的提取质粒DNA的提取•碱裂解法•煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取•差速离心结合SDS裂解法CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。生物秀-专心做生物www.bbioo.com生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.comCTAB法流程图植物材料裂解液异丙醇沉淀液氮研磨抽提离心洗涤DNA溶液细胞裂解上层溶液干燥溶解CTAB中各个组分的作用CTAB提取缓冲液的经典配方Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+离子或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。CTAB提取缓冲液的改进配方PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。除蛋白质：氯仿/异戊醇抽提(氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离；异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的气泡）。使用变性剂变性(SDS.异硫氰酸胍等）高盐洗涤蛋白酶处理除多糖：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5MNaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。除酚类物质：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇.抗坏血酸.半胱氨酸.二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP.PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合除盐离子：70％的乙醇洗涤TE中成分的作用TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解称取样品，液氮研磨，加入预热的(65℃)CTAB及β-巯基乙醇保温1h,期间不停的摇均吸取上清液,移至新的离心管中,加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻缓颠倒混匀,10000rpm,10min取上清液，移至新的离心管中,加等体积氯仿：异戊醇,颠倒混匀,10000rpm,10min取上清液，加入0.6-0.7V的异丙醇（预冷），后4℃/-20℃保温沉淀10000rpm,10min离心取沉淀，70%乙醇清洗两次，吹干用TE溶解DNA,然后低温保存应注意的问题材料准备：最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融。液氮研磨：研磨样品时要有液氮的保护，在整个过程中都不要让液氮挥发干净。避免材料回温和反复冻融带来的降解。此外尽量将样品研磨的很细，这样可以提高DNA产量。细胞细胞裂裂解：解：材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低。高温温浴时，定时轻柔振荡。应注意的问题DNA沉淀：用乙醇或异丙醇都可以。异丙醇沉淀的效率要...