FPLC使用指南From:USTC|Date:2016-12-01简介（INTRODUCTION）FPLC全称为快速蛋白液相色谱（Fastproteinliquidchromatography），其原理与高效液相色谱理论类似，是由经典的液体柱层析引入气相色谱理论，并且对相体进行了改革，配用高压输液泵，采用高灵敏检测器、梯度洗脱装置、自动收集装置和微机等发展起来的现代液相色谱。我们实验室有两套纯化仪，一台是AKTAprimeplus（着重介绍），另外一台是AKTApureprotein(简单介绍）。AKTAPure纯化系统（详见AKTAPureonsite-training）AKTAPrimePlus纯化系统?安全(Safety)?组件(Components)?方法编程(Methodprogramming)?使用方法(Usage)?维护注意事项(Maintenance)安全(Safety)1.警告！系统必须与接地电源插座连接。2.警告！用户不能打开系统，因为系统含高压电路，会造成致命的电击。3.警告！必须总有上样环连接在上样阀的接口2和6。这是为了在转换此阀时防止液体从这些接口喷出。尤其是使用危险化学品时，这是特别危险的。4.警告！如果有大量溢出的液体渗入系统外壳并同带电部件接触的危险，应立即关闭系统并同指定的技术服务人员联系。5.警告！NaOH有害健康，应避免泄漏。?组件（Components）AKTAprimeplus蛋白质纯化系统包括下列部件：1.缓冲液阀和梯度转换阀(Buffervalveandgradientswitchvalve)：缓冲液阀用于选择使用缓冲溶液，用于系统泵施加大的样品体积。梯度转换阀用于建立梯度。2.系统泵(Systempump)：系统泵用于经系统运送液体，如样品或缓冲溶液。将液体经缓冲液阀、梯度转换阀或经上样阀进入流动通道。3.压力传感器(Pressuresensor)：压力传感器可以测量在位液体压力。还可用作压力保护装置。4.混合器(Mixer)：混合器用于混合两元梯度。以两步将溶液混合以得到最适宜的结果。混合器的体积可以选择。5.上样阀(Injectionvalve)：上样阀用于装加样环和用于将样品注射到柱上。6.检测器(Monitor)：检测器的目的是测量流出柱后液体的UV吸收、电导率和pH（任选）。用于这些测量的流动池安装在系统的右侧。7.具有分流阀的分部收集器(Fractioncollectorwithflowdiversionvalve)：分部收集器用于将样品组分收集在管中供进一步分析。分流阀在废液和收集管之间转换流向。?方法编程（Methodprogramming)主菜单概要?Template该菜单出现在自检后启动时，用于运行予制的应用模板和法模板。RunstoredMethod用于运行用户编辑的运行方法ManualRun用于不使用方法,手工运行系统。ProgramMethod用于编辑用户专用方法。SetParameters用于对检测紫外(UV)、电导、pH、温度、和运转泵及混合器设置参数。Check用于检测系统内部参数，例如序列号、泵运行时间、和灯亮度。使用方法（Usage)利用AKTAPrimePlus洗脱镍柱中的蛋白（以5mL镍柱为例）1.打开AKTA（机器背部左下角），将A泵和B泵用蒸馏水冲洗干净分别插入到Ni-bindingbuffer和Elutionbuffer中，并在Template中选择systemwash，洗泵(大概五分钟）。2.systemwash完毕后，先选择manualrun，%B=0，pressurelimitation=MPa，流速=1ml/min。先将Ni柱底部接到探测器上，再将1号接线口接到镍柱上端（这样可以防止绿色线管扭曲），观察电脑屏幕待UV线、电导线平齐时Endprogram。3.设定程序：流速3ml/min，limitpressure为MPa设定breakpoint：0ml：%B=4，setfractionsize=020ml：开始拉梯度，%B=4；开始收集样品，setfractionsize3ml/tube80ml：%B=60；同时也一直在收集样品，setfractionsize3ml/tube100ml：%B=60（有时有些蛋白量很大或者延时出来，可以设这个程序，以防万一），setfractionsize3ml/tubeEnd4.蛋白纯化结束后，要清洗AKTA泵内部溶液，方便下位同学使用，将A泵和B泵用蒸馏水冲洗干净插入到蒸馏水中，并在Template中选择systemwash，洗A、B泵。用蒸馏水清洗完毕后如果长期不用机器，需要用20%酒精再次清洗系统泵。并将收集器上的玻璃管收拾干净，并用水清洗，放于管架晾干。（总之，意思就是：0ml时所有的系统全部要求置零，0-20ml区间跑4%elutionbuffer把杂蛋白洗下来。20-80ml区间设定elutionbuffer的浓度从4%慢慢升到60%同时收集样品，80-100ml区间用60%把剩余蛋白全部洗脱下来并收集样品...
