05 版药典微生物限度检查法操作要点林丽英05 版药典微生物限度检查法与以往药典的最大不同就是多了方法验证。由于以前版本的药典没有要求对检验方法进行必要的验证，所以大家都觉得不好理解、不好难操作。为了更好执行 05 版药典，现根据我的理解，对药典上的各种检验方法在验证时的操作要点与大家作个探讨。一、验证的目的由于制剂在投料和加工过程中，或有抑菌成份存在，或由于各种成份相互作用的结果，将可能对某些类型的微生物的检出产生影响。对所建立的微生物限度检查法进行验证的目的，就是要对每个样品使用适宜的检验方法，顺利的检出样品中污染的各种类型的菌。细菌计数验证所用的菌株：大肠埃希菌[CMCC（B）44102]：代表革兰阴性菌；金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]：代表革兰阳性球菌； 枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]：代表革兰阳性杆菌；霉菌计数验证所用的菌株：白色念珠菌[CMCC（F）98001]：代表酵母菌；黑曲霉[CMCC（F）98003：代表霉菌；由于每个菌株代表不同类型的菌，所以只有这五个菌株的回收率均达到要求，才表明样品中污染的各种类型的菌都可能检出来，否则，所得的结果是不能真实地反映样品的污染情况的。菌液的制备：接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养 18～24 小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养 24～48 小时。上述培养物用 0.9％无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌数为 50～l00cfu 的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养 5~7 天，加入 3~5ml 0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出胞子悬液(用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无菌试管内，用 0.9％无菌氯化钠溶液制成每 lml 含孢子数 50～l00cfu 的孢子悬液。二、方法的验证所有验证方法的操作均应在阳性接种间。（一）、细菌、霉菌和酵母菌计数法的验证验证方法 取试验可能用的最低稀释级供试液进行验证。验证试验至少应进行 3 次独立的平行试验，并分别计算各试验菌株每次试验的回收率。 1．常规法就是取 1:10 的供试液 1ml 和 50~100 个试验菌株加入到 1 个平皿中，立即倾注相应的琼脂培养基，每株试验菌平行制备 2 个平皿，培养，计算各菌株的回收率。常规法做一个样品的细菌、霉菌和酵母菌计数验证试验，需要多少个平皿呢？试验组：5×2=10 个，即每个菌...
