原核诱导表达汇总VIP免费

1 原核诱导表达的标准操作程序（SOP）一．目的：使本实验室工作人员了解诱导表达的操作过程，并能实际动手进行原核诱导表达一系列实验。二．适用范围：本 SOP 适用于对新基因克隆的表达，并针对新基因产生的可溶性蛋白。三．实验原理：E.coli的乳糖操纵子含Z、 Y 及 A 三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P 及一个调节基因I。I 基因编码一种阻遏蛋白，后者与O 序列结合，使操纵子受阻遏而处于关闭状态。在启动序列 P 上游还有一个代谢物基因激活蛋白（CAP ）结合位点。由P 序列、 O 序列和CAP结合位点共同构成lac 操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。在没有乳糖存在时，lac 操纵子处于阻遏状态。此时，I 序列在 PI 启动序列操纵下表达的Lac 阻遏蛋白与O 序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac 操纵子即可被诱导。在这个操纵子体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与 O 序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG ）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。四、试剂准备: （一）实验器材的灭菌：枪头的灭菌：1mL ， 200μL ， 20μL 的枪头放入枪头盒，用报纸包住（2 层），放入高压灭菌锅中灭菌， 121 ℃， 20min 。 80℃烘箱中烘干，常温放置。螺口管及离心管的灭菌：将螺口管和离心管分别放入铝制饭盒中（盖子要拧松，离心管的管盖打开），放入高压灭菌锅中灭菌，121 ℃， 20min 。80 ℃烘箱中烘干，常温放置。50mL 离心管的灭菌：将 50mL离心管用报纸包住（2 层），放入高压灭菌锅中灭菌，121℃， 20min 。80℃烘箱中烘干，常温放置。（二） LB 培养基的配制液体 LB 培养基（1L ）：蛋白胨10g 氯化钠10g 酵母提取物5g 调 PH 值到7.5，高压灭菌，4℃保存。固体 LB 培养基（1L ）：蛋白胨10g 2 氯化钠10g 酵母提取物5g 琼脂粉15g 高压灭菌，不烫手的情况下加入抗性，抗性：培养基=1：1000 （氨苄，卡那通常浓度），混匀。马上在无菌操作台中倒平板，并开大风吹干。用封口膜封住，倒置放于 4℃保存。（三） 1M IPTG的配制：经过计算，10g IPTG可以配42ml 的 1M IPTG 。...