PCR扩增失败的原因分析VIP免费

PCR 扩 增 失 败 的 原 因 分析 2010-12-13 16:48:31| 分类： 默认分类|字号 订阅 PCR 扩增失败原因分析，PCR 产物电泳 2010-05-15 16:07 一 模板质量问题： 1）模板提取不完整，其中不含你的目的基因，或目的基因含量太低。可以跑个电泳看看提取的DNA，PCR 阳性样品与阴性样品是否有明显差别。如果确定是这种问题，可以增加模板量试试，但不一定行得通。 2）模板里面残留某种试剂成份，可能抑制 Taq 聚合酶的活性，如果是这种情况，可以用试剂盒把模板再纯化一下，或将模板做个梯度稀释以确定最佳的模板量。 3） 为什么跑电泳会出现拖带呢？ 1. 有可能的因为你的电压调的太高了。电泳跟很多因素有关，其中就有一个是电压，在适当的电压范围内增加是可以加快迁移速率，但是要是超到一个临界值反而有害。你可以适当的调低点看看。 2.有时候发现上样量太多的话会有拖带。你看能否回收之后 ，按1:50 或1:100 等稀释后，再当成模板扩一次怎 么样。 二 引 物问题 1）样品自 身 的基因型 差异 导 致 扩增失败。也 就是说 你的引 物与某些基因型 的样品结 合的好 ，而和 另 一些 基因型 结 合不好 。可以换 一对 更 保 守 的引 物试试。祝 顺 利 ！ 2）普 通 PCR 所 用的一对 引 物中有一个引 物加多了，为正 常 的三 倍只 要引 物特 异 性比 较 好 ，那 么不会产生 大 的影 响 。如果恰 巧 是加多的这条 引 物不是很特 异 的话，也 许 会扩出来 非 特 异 带。 在制备 单 链 探 针 时候就采 取这样的不对 称 pcr，没 关系 的 三 Taq 酶处 于 失活状 态 。因为活性降 低了能出现二 聚体 。 tap 酶种类 高特 异 性 Taq 酶 高度特 异 性地 扩增所 需 的片 段 是 PCR 最基本 的要求 ，影 响 PCR 特 异 性的因素很多，包括模板、引物性质及质量、反应条件的控制等等，而高特异性 Taq酶的出现大大减少了摸条件这一繁琐的实验过程，也为 PCR 产物快速有效的纯化（PCR 产物直接纯化）打下了基础。这类酶最典型的代表是热启动 Taq 酶。大家都知道，在 PCR 第一个循环变性之前，有一个升温的过程，引物和模板会有一些非特异性配对，如果这时 Taq 酶发挥活性，就很容易产生非特异性扩增，由于循环初期模板量非常少，产生的非特异性条带经过后面的指数扩增，就会严重干扰目的片段的扩增，甚至导致特异...