动物寄生虫病PCR诊断技术VIP免费

动物寄生虫病PCR诊断技术聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction,PCR）技术是一种既敏感又特异的DNA体外扩增方法，它可将一小段目的DNA扩增上百万倍，其扩增效率使得该方法可检测到单个虫体或仅部分虫体的微量DNA。通过设计种、株特异的引物，此法只扩增出种、株特异的PCR产物，具有很高的特异性。而且PCR技术的操作过程也相对简便快捷，无需对病原进行分离纯化；同时可以克服抗原和抗体持续存在的干扰，直接检测到病原体的DNA，既可用于虫种、株的鉴别，动物寄生虫病的临床诊断，又可用于动物寄生虫病的分子流行病学调查。随着PCR技术的不断完善与发展，它已广泛应用于分子生物学、生物技术、临床医学等各个领域，具有广泛的应用前景。一、实验目的要求掌握PCR诊断技术所涉及实验的基本原理，全面熟悉PCR诊断技术的操作过程，其中包括寄生虫DNA的提取、PCR引物的设计、PCR条件的优化、对目的片断的扩增、琼脂糖凝胶电泳及结果分析、PCR产物的纯化等等。二、实验仪器和材料（一）寄生虫基因组DNA的提取及纯化1.虫体材料。单个虫体。2.器具。超净工作台、恒温培养箱、TGL-16G高速台式离心机、旋涡振荡器、微量取液器及配套吸头、微量离心管、一次性注射器、微型眼科镊、微型眼科剪刀、玻璃平皿、滴管、有机架等。3.试剂。(1)乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA）、十二烷基磺酸钠（Sodiumdodecylsulfate，SDS）、三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸（Tri(Hydroxymethyl)Aminomethane-HCl，Tris-HCl）、氯化钠、蛋白酶K（25µg/µl）、异丙醇（80%）、双蒸水、灭菌超纯水等。(2)DNA裂解液：500mMNaCl70µl、100mMTris-HCl（pH8.0）30µl、50mMEDTA（pH8.0）150µl、10%SDS30µl。(3)WizardTMDNAClean-Up试剂盒或类似的DNA提取试剂盒。（二）PCR扩增及琼脂糖电泳1．材料。提纯的虫体DNA。2．器具。超净工作台、微型高速台式离心机、微量取液器（2/20/200/1000µl）、PCR扩增仪、琼脂糖电泳系统、凝胶成像系统、微波炉、4℃/-20℃冰箱、紫外透射仪、微型离心管（200/500/1500µl）、有机架、一次性手套、透明胶带、量筒（100ml）、三角瓶（500ml）等。3．试剂。(1)10×PCRBuffer（无Mg2+）、dNTP（2.5mMeach）、ddH2O、MgCl2（25mM）、Primers、ExTaq酶（5U/l）、琼脂糖、EB（10mg/ml）、Tris碱、硼酸（Boricacid）、去离子水、EDTA（0.5mol/L，pH8.0）、10×载样缓冲液。(2)0.5×TBE缓冲液：准确秤取Tris碱5.4g，硼酸2.75g，充分溶解于800ml去离子水中，加10ml0.5mol/LEDTA（pH8.0），用去离子水定容至1000ml。（三）PCR扩增产物的纯化1．材料。PCR扩增产物。2．器具。TGL-16G高速台式离心机；三用电热恒温水箱；微量取液器（2/20/200/1000µl）、琼脂糖电泳系统、微波炉、电子天平、4℃/-20℃冰箱、紫外透射仪、微型离心管（500/1500µl）、有机架、透明胶带、一次性注射器、量筒（100ml）、三角瓶（500ml）、手术刀、保鲜纸等。3．试剂。琼脂糖；0.5×TBE缓冲液；UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒；UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒；异丙醇（80%）等。三、实验方法、步骤和操作要领(一)寄生虫基因组DNA的提取及纯化1.实验原理。应根据研究目的来决定是从单个虫体还是多个虫体提取基因组DNA。寄生虫虫体的各个1部位都可以作为基因组DNA的抽提材料，如果虫体较大的话可取其中部而保存其头部及尾部，以备形态学鉴定以验证其种类。如果虫体较小（小于1cm），则应使用整条虫体抽取DNA。若虫体特别细小（例如幼虫），可用多条虫体来提取DNA。为了获得高含量、高纯度的DNA，最好使用新鲜材料。从冻干或50%-70%乙醇保存的寄生虫材料中也可较容易地提取DNA。寄生虫DNA的抽提方法有多种，不同种类的寄生虫虫体都有其最适合的抽提方法，但各种方法的基本原理都一样，即先用机械的方法将虫体组织破碎，然后加入DNA裂解液和蛋白酶K，充分作用后，虫体组织中的细胞膜破裂，蛋白质变性，将虫体基因组DNA释放到溶液中。在裂解过程中，虫体细胞碎片及大部分蛋白质会相互缠绕成大型复合物，后者被DNA裂解液中的SDS包盖，通过离心沉淀，这些复合物会从溶液中沉淀下来，变性剂也同时被除去，从而就可...