miScript PCR 系统操作手册 试剂盒成分： miScript Reverse Transcription Kit miScript Primer Assays miScript SYBR® Green PCR Kit 10x miScript Primer Assay 和10x miScript Precursor Assay 是干粉状的，需要稀释。首先短暂离心小管，然后加入550μl TE，pH 8.0，最后在漩涡震荡仪上4-6 次。为了保持引物的活性，在冷冻条件下将稀释的引物分装成小管。 实验步骤：反转录反应 1、 在冰上融化RNA，室温下(15–25ºC)融化5x miScript RT Buffer 和RNasefree water 。 先轻弹每个小管使其充分混匀，然后短暂离心以收集管壁和管盖上的液体，最后放置在冰上。 2、 在冰上配制reverse-transcription master mix。 配好后混合并放置在冰上。如果miScript Reverse Transcriptase Mix是从-20°C冰箱拿出来的话，那么在使用完毕后立刻放入冰箱。 如果要配制多次反应，先在一个大管中准备Mix，并且多配制10%。 3、 将miScript Reverse Transcriptase Mix分装到每个小管中，然后加入RNA。 4、 在37°C下孵育60分钟 5、 在95°C下孵育5分钟以灭活miScript Reverse Transcriptase Mix 6、 如果马上进行PCR，讲产物放置在冰上；如果不立刻做PCR，那么将反转录产物放置在-20°C 实验步骤：Real-Time PCR检测miRNA或Noncoding RNA 1、 融化2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix，10x miScript Universal Primer, 10x miScript Primer Assay, template cDNA, 和RNase-free water。用前分别混匀各试剂。 2、 按下表准备反应mix。 因为PCR反应是热启动反应，所以在配制mix时不须放置在冰上。cDNA的添加量不要超过PCR反应体系的10%。 3、 加入模板cDNA到每个小管中 如果同时检测miRNA和miRNA前体，miRNA的cDNA加入量就要和检测前体时的加入量相同（10-20ng）。 4、 充分混合好反应mix然后分装到有cDNA的小管中。 5、 短暂离心 6、 按一下程序进行PCR反应 在每次PCR反应中都要实施融解曲线，以确定反应的特异性和一致性。 miRNA-specific PCR 产物的Tm值大概为74–77°C。 合成的单链miRNA可以用来作为内部的阳性对照。和miRNA同时进行融解曲线分析。也可以进行cDNA合成后再进行标准曲线构建以确定miRNA的拷贝数。 实验步骤：Real-Time PCR for Detection of Precursor miRNA RNA纯化步骤必须包含基因组DNA去除步骤。并且要求有“no RT”control...
