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RT-PCR 技术 RT-PCR 简介 RT-PCR 的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR 广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA 的含量。（检测基因表达的方法，参见Northern Blot 法。） RT-PCR 有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative PCR)。 实时PCR 实时PCR(real-time PCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内 DNA 的增幅量为基础进行 DNA 的定量分析。 real time PCR 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。一种是在 ds DNA（双链 DNA）中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅 DNA 序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。 real time PCR 与 reverse transcription PCR(反转录PCR) 相结合，能用微量的RNA 来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种RT PCR 的组合又被称之为“定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）” RT-PCR 技术相关试剂 oligo: 多聚体，相当于mRNA 引物 AMV（M-MLV）：逆转录酶 dNTP：脱氧核苷酸 RNase：RNA 酶抑制剂 PCR Buffer：RT-PCR 缓冲液 MgCl2：2 价镁离子 PCR 各步骤的目的 （一）预变性： 破坏DNA 中可能存在的较 难 破坏的二级 结构 。 使 DNA 充 分变性，减 少DNA 复 杂 结构 对 扩增的影 响 ，以利 于引物更 好 的和 模 板 结合，特别是对 于基因组来源 的DNA 模 板 ，最 好 不 要 吝 啬 这个 步骤。此 外 ，在一些 使用热 启动Taq 酶的反应中，还 可激 活Taq 酶，从 而 使 PCR 反应得 以顺 利 进行。 （二）变性--退 火 --延 伸 循 环 ： ①模板DNA 的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA 与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA 模板--引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，以dNTP 为 反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。 （三）PCR 仪扩增循环后 72 度延伸 10 分钟 用 PCR 仪扩增时,(变性.退火,...