Site-Directed Mu tagenesis 本贴先讲最简单的一个点的定点突变技术，其它较长片段的突变，删除，插入技术以后会慢慢奉上： 在做实验之前，我们首先要搞清楚实验的目的和实验的原理。 实验的目的应该比较明确吧：就是要把自己的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。一般情况下我们会有几种可能使我们需要这样去做： 第一：我们吊出来的基因有点突变，相信这可能是大家经常会遇到的问题。基因好不容易吊出来，并装进了自己的载体，却发现有一两个碱基跟自己的预期序列或所有的公共数据库不匹配，然后暴昏。 大家实验室里面还是用 Taq 酶为主吧，Pfu 这样的高保真酶大家应该用得不多吧，Taq 酶的优点和缺点都很明显：优点就是扩增效能强，缺点就是保真性差，其错配机率是比较高的，相关数字忘了，大家可以去网上查那个数字，不过感觉如果是2000bp 的基因，如果扩四五十个循环的话，很大机率会出现点突变，当然这也跟具体 PCR 体系里的Bu ffer 有很大关系，详细情况这里就不讨论了。 第二：要研究基因的功能，在基因上自己选定位置更换碱基的保守序列，或者改造成不同的亚型，总之就是要人工改造碱基序列符合自己的实验需要，相信这也是那些研究基因的人经常的一种思路吧。 对于第一种情况：我们首先要分析出现碱基不匹配的位置是不是重要的位置，如果不是很重要，大可不必管它，比如说是三联密码子的最后一位，碱基的改变并没有引起相应氨基酸的改变，那么一般情况下也可以不去理它。另外，在NCBI 上人类的基因的版本一直在变化，也就是说同一个基因有不同的版本，或者称不同的亚型，其碱基序列有些许的差异，只要自己克隆出来的碱基序列与其中一个相匹配，一般也就可以不做定点突变了。如果有时间没钱，那干脆重新 PCR 然后再克隆进自己的载体了，不过最好换个保真性好一点的酶如 PFU，或者 PCR 循环数低一点，不过这些东西有时候也得靠运气啦。实在不行的话再来做定点突变。 对于第二种情况：这种情况下一般也就只能做定点突变了。 接下来开始聊一聊定点突变的原理吧，那个Stratagene 试剂盒！上面有一个说明书，说得好像很正规，不过上面好多都是什么专利啊什么注意之类的话，看都不看，我们简明扼要地只讲实验方面，通过设计引物，并利用PCR 将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR 产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。 大家马上就会想到几...
