线粒体DNA的提取方法VIP免费

线粒体DNA的提取方法ProtocolforExtractingMitochondriaDNAprotocol从植物组织提取高纯度线粒体从植物组织提取高纯度线粒体DNADNA实验目的11、、4000rpm4000rpm离心可以沉淀分离出叶绿离心可以沉淀分离出叶绿体、细胞核和组织碎片，体、细胞核和组织碎片，12,000rpm12,000rpm离离心才可沉淀分离线粒体。心才可沉淀分离线粒体。实验原理33、、SDSSDS可以从植物各样组织类型中释放可以从植物各样组织类型中释放和结合的细胞核酸。和结合的细胞核酸。22、用蔗糖浓度梯度纯化线粒体，不同浓度、用蔗糖浓度梯度纯化线粒体，不同浓度蔗糖的缓冲液因比重不同而分层。蔗糖的缓冲液因比重不同而分层。研钵和研杵；冷冻离心机；过滤装置（漏研钵和研杵；冷冻离心机；过滤装置（漏斗，玻棒）斗，玻棒）pHpH计；移液器；水浴箱；计；移液器；水浴箱；50m50mLL离心管；离心管；22；；1.5mL1.5mL离心管。离心管。Apparatus:Apparatus:仪器设备仪器设备：：mortar(cold);Centrifuged;filter;pHmeter;wamortar(cold);Centrifuged;filter;pHmeter;waterbathboiler;50mLcentrifugaltube;eppendoterbathboiler;50mLcentrifugaltube;eppendorftube.rftube.试剂：试剂：ReagentandsolutionReagentandsolutionAbuffer:10mmol/LTris-HCL，pH7.4；500mmol/L；20mmol/LEDTA；0.2%BSA；0.2%β-mercaptoethanolBbuffer:10mmol/LTris-HCL，pH7.4；600mmol/Lsucrose;20mmol/LEDTALysisbuffer:50mmol/LTris-HCL，pH8.0；20mmol/LEDTA试剂：试剂：ReagentandsolutionReagentandsolution缓冲液A：10mmol/LTris-HCL，pH7.4；500mmol/L蔗糖；20mmol/LEDTA；0.2%BSA；0.2%β-巯基乙醇缓冲液B：10mmol/LTris-HCL，pH7.4；600mmol/L蔗糖；20mmol/LEDTA裂解缓冲液：50mmol/LTris-HCL，pH8.0；20mmol/LEDTA操作步骤操作步骤线粒体的提取及纯化线粒体的提取及纯化MitochondriaisolationMitochondriaisolationProtocolProtocol1.1.将一定鲜重（将一定鲜重（FWFW）的黄化苗剪成）的黄化苗剪成2~3cm2~3cm的小段，的小段，倒入倒入5ml/gFW5ml/gFW的缓冲液的缓冲液AA，然后在冰水浴（以下未，然后在冰水浴（以下未加说明，操作温度均为加说明，操作温度均为0~4℃0~4℃）中进行研磨。研磨液）中进行研磨。研磨液用用88层纱布过滤，滤液经层纱布过滤，滤液经4000rpm4000rpm离心离心15min15min。。1.Harvest10gdark-grownetiolatedseedlings,coolthe1.Harvest10gdark-grownetiolatedseedlings,coolthemto0.Conductthesubsequentoperationsonice.℃mto0.Conductthesubsequentoperationsonice.℃Homogenizetheseedingsinthemortarwith50mlofAHomogenizetheseedingsinthemortarwith50mlofAbuffer.Filterthehomogenatethrough(8-layermuslincbuffer.Filterthehomogenatethrough(8-layermuslincloth)andcentrifugetheextractat4000rpm,for15min.loth)andcentrifugetheextractat4000rpm,for15min.2.2.取①中的上清，再经取①中的上清，再经12000rpm12000rpm离心离心20min20min。弃上清，。弃上清，往此沉淀中加入往此沉淀中加入0.1mL/gFW0.1mL/gFW的缓冲液的缓冲液AA，用毛笔轻，用毛笔轻轻悬浮，悬浮液再经轻悬浮，悬浮液再经4000rpm4000rpm离心离心15min15min。。2.Discardthenucleipellet,centrifugethesupernatanta2.Discardthenucleipellet,centrifugethesupernatantat12,000rpm,for20min.Re-suspendthepelletgentlybyt12,000rpm,for20min.Re-suspendthepelletgentlybyusingasoftpaintbrush,centrifugeat12,000rpm,for20usingasoftpaintbrush,centrifugeat12,000rpm,for20min.Re-suspendtheorganellepelletwithasoftpaintbrmin.Re-suspendtheorganellepelletwithasoftpaintbrusinminimalvolumeofAbuffer(0.1mL/gFW).CentusinminimalvolumeofAbuffer(0.1mL/gFW).Centrifugeat4000rpm,for15min.rifugeat4000rpm,for15min.3.取②中的上清，加入DNaseI及MgCL2，使两者的最终浓度分别为10μg/gFW和10mmol/L，在4℃下反应1h，再加入EDTA至100mmol/L，以终止DNaseI的反应。Discardtheresidue,DNase-1andMgCL2wereaddedtotheplantmaterialtoma...