第一章 目录 第一章 质粒DNA 的分离、纯化和鉴定 第二章 DNA 酶切及凝胶电泳 第三章 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 第四章 RNA 的提取和 cDNA 合成 第五章 重组质粒的连接、转化及筛选 第六章 基因组 DNA 的提取 第七章 RFLP 和 RAPD 技术 第八章 聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆 第九章 分子杂交技术 第十章 测序技术 第二章 质粒DNA 的分离、纯化和鉴定 第一节 概 述 把一个有用的目的DNA 片段通过重组 DNA 技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组 DNA 技术中常用的载体。 质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从 1-200kb 不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如 离开 宿主细胞则 不能存活 ,而 宿主即 使 没 有它们 也 可 以正 常存活 。质粒的存在使 宿主具有一些额 外的特 性 ,如 对 抗 生 素 的抗 性 等。F 质粒(又称 F 因子或 性 质粒)、R 质粒(抗 药 性 因子)和 Col 质粒(产大肠杆菌素 因子)等都 是常见 的天 然 质粒。 质粒在细胞内 的复制一般 有两 种类 型 :紧 密 控 制型 (Stringent control)和松 驰 控 制型 (Relaxed control)。前 者 只 在细胞周 期 的一定阶 段进行复制,当 染色体不复制时 ,它也 不能复制,通常每 个细胞内 只 含 有 1 个或 几 个质粒分子,如 F 因子。后 者 的质粒在整 个细胞周 期 中随 时 可 以复制,在每 个细胞中有许 多 拷贝,一般 在 20 个以上 ,如Col E1 质粒。在使 用蛋白质合成抑 制剂 -氯 霉 素 时 ,细胞内 蛋白质合成、染色体 DNA 复制和细胞分裂 均 受到 抑 制,紧 密 型 质粒复制停 止 ,而 松 驰 型 质粒继续 复制,质粒拷贝数可 由 原 来 20 多 个扩增至 1000-3000 个,此 时 质粒DNA 占 总 DNA 的含 量 可 由原 来 的2%增加 至 40-50%。 利 用同 一复制系 统 的不同 质粒不能在同 一宿主细胞中共 同 存在,当 两 种质粒同 时 导 入 同 一细胞时 ,它们 在复制及随 后 分配 到 子细胞的过程 中彼 此 竞 争 ,在一...
