分子生物学与细胞生物学实验基本技术VIP免费

分子生物学与细胞生物学实验基本技术 2005-02 实验一 组织块培养法 一、目的 学习原代培养方法，从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。 二、概述 组织块培养法是常用的、简便易行和成功率较高的原代培养方法。可以采用剪切法，即将组织块剪切成小块后，接种于培养瓶，组织小块贴壁 24h或更长时间后，细胞就从组织四周游出。但由于在反复剪切和接种过程中对组织块的损伤，并不是每个小块都能长出细胞。用于组织块培养的培养瓶可根据不同细胞生长的需要作适当处理，如预先涂以胶原薄层，以利于上皮样细胞等的生长。（本节以新生牛主动脉平滑肌培养为例） 三、材料 （一） 仪器 1. 净化工作台 2. 恒温水浴箱 3. 冰箱（4℃、-20℃） 4. 倒臵相差显微镜 5. 培养箱 （二） 玻璃器皿 1. 培养皿（Φ100mm） 2. 吸管（弯头） 3. 烧杯（500ml、200ml、10ml） 4. 广口试剂瓶（500ml） 5. 玻璃瓶（250ml、100ml） 6. 培养瓶 7. 废液缸 （三） 塑料器皿 1. 吸头 2. 枪头 3. 胶塞 4. EP管 （四） 其他物品 1. 微量加样枪 2. 眼科组织剪（直尖、弯） 3. 眼科组织镊（直、弯） 4. 12.5cm组织镊（无钩、1×2钩） 5. 25cm敷料镊（无钩） 6. 止血钳（18cm直纹式、12.5cm直纹式、弯纹式） 7. 解剖剪 （五） 试剂 1. D-Hanks液 2. 小牛血清 3. RPMI1640 4. 双抗（青霉素、链霉素） 5. 1N HCl 6. 7.4%NaHCO3 四、操作步骤 1. 取材：打开胸腔，无菌操作下取出主动脉胸段，浸到预先配制好的含双抗（500u/ml青、链酶素）的 D-Hanks液中漂洗。 2. 组织的冲洗、修剪：取出主动脉，用锋利的剪刀修剪除去周围组织，再用 D-Hanks冲洗主动脉 3次，除去血块及杂组织等。 3. 平滑肌组织分离：纵向剖开主动脉，撕下主动脉内层，取主动脉中层的平滑肌组织，无血清 RPMI1640漂洗 3次。 4. 剪切：将平滑肌组织用锋利的眼科剪反复剪切至剪成 1mm3小块，在剪切过程中，可以适当向组织中滴加 1～2滴培养液，以保持湿润。 5. 贴块：将剪切好的组织小块，用眼科镊送入培养瓶内，用弯头吸管将组织块均匀摆臵，每小块间距 0.5cm左右，组织块放臵好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内注入适量含 10%牛血清培养液，盖好瓶盖。 6. 培养：将培养瓶瓶底朝上，37℃培养箱放臵 2～4h，待组织小块贴附后，将培养瓶慢慢翻转平放，静臵培养。 7. 换液：原代培养 3～5d，需换液一次...