影响 PCR 反应的条件(1) 引物：引物是 PCR 特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA 互补的程度。设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30bp，常用为 20bp 左右。②引物扩增跨度：以200-500bp 为宜，特定条件下可扩增长至10kb 的片段。③引物碱基： G+C 含量以 40-60% 为宜， G+C 太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。 ATGC 最好随机分布 ，避免 5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。⑤引物 3'端的碱基， 特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR 失败。⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度 0.1～1umol 或10～100pmol ，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。(2)酶及其浓度目前有两种Taq DNA 聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR 反应约 需酶量 2.5U(指总反应体积为100ul 时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。(3)dNTP 的质量与浓度dNTP 的质量与浓度和PCR 扩增效率有密切关系， dNTP 粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP 溶液呈酸性， 使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris.HCL的缓冲液将其PH 调节到 7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使 dNTP 降解。在 PCR 反应中， dNTP 应为 50～200umol/L ，尤其是注意 4种 dNTP 的浓度要相等 ( 等摩尔配制 )，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低 )，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR 产物的产量。 dNTP 能与 Mg2+ 结合，使游离的Mg2+ 浓度降低。(4)模板 (靶基因 )核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR 成败与否的关键环节之一，传统的DNA 纯化方法通常采用SDS 和蛋白酶K 来消化处理标本。SDS 的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶 K 能水解消化蛋白质，特别是...
