PCR原理简介及核酸提取要点PCR技术的实操及应用（一）讲师：李超聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）作为分子生物学领域的“常青树”，发展至今已被广泛应用于生物学基础研究、种源鉴定、精准医疗、微生物检测等多个领域。本课程主要从食品检验检测的角度出发，以SN/T1632.2—2013出口奶粉中阪崎肠杆菌检验方法第二部分：PCR方法为例，详细阐述PCR技术在实际操作过程中的各个环节，并对可能遇到的问题进行重点分析。本课程概要课程简介PCR技术的实操及应（一）课程大纲什么是聚合酶链式反应（PCR）？食品检测领域中有哪些标准涉及PCR操作？PCR操作需要哪些试剂和设备？核酸提取过程中有哪些注意事项？核酸检测实验室区域如何划分？科普时刻什么是聚合酶链式反应（PCR）？聚合酶链式反应的定义聚合酶链式反应（PCR)是一种DNA体外核酸扩增技术。该技术能在短时间内将极微量的目的基因或某DNA片段扩增至十万乃至百万倍，从极微量的标本中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。聚合酶链式反应（PCR）的基本原理根据DNA的半保留复制，双链DNA分子在高温下变性成为单链DNA分子；单链DNA分子与引物在退火过程中由于碱基互补配对结合；在DNA聚合酶的催化作用下，使引物沿单链模板延伸为双链DNA，实现DNA的扩增。因此，PCR由三个基本反应步骤构成，即变性、退火、延伸。变性退火延伸Step1Step2Step3PCR的原理示意图（一）TargetSequenceTargetSequence95℃PCR的原理示意图（二）55℃TargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’PCR的原理示意图（三）72℃TargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer2TaqDNAPolymerasePCR动画示意图cyclesPCR的原理示意图（四）30cycles1,073,741,824核酸检测实验室区域划分1234试剂准备室样品制备室扩增室产物分析室56传递仓实验室过道核酸检测实验室区域划分1试剂准备室3扩增室4产物分析室2样品制备室清洁半污染污染QUESTIONONE食品检测领域涉及PCR的标准有哪些？PCR技术在食品检测领域的应用GB4789.6—2016GB4789.12—2016SN/T1869—2007SN/T3731.5—2013SN/T2978—2011SN/T2525—2010GB/T23815—2009GB/T19495.4—2004SN/T1632.2—2013GB4789.42—2016以SN/T1632.2—2013出口奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）检验方法第二部分：PCR方法为例，阐述PCR技术在实际操作过程中的各个环节。阪崎肠杆菌简介•兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌•周生鞭毛、能运动•无芽孢•隶属于肠杆菌科D-山梨醇-吐温80脂酶+细胞外Dnase+氧化酶试验-黄色菌落+α-葡萄糖苷酶+易感人群和临床特征•新生儿（低出生体重等免疫力低下）•早产儿•老年人•免疫功能低下的成年人•脑膜炎、坏死性小肠结肠炎和菌血症•死亡率高达40%—80%•长期的并发症包括迟发型神经发育、脑积水和永久性的神经损伤等易感人群临床症状QUESTIONTWOPCR操作需要哪些试剂和主要仪器？主要设备食品微生物检测、动物源性成分鉴定中涉及PCR操作时所需要用到的主要仪器设备。主要试剂正向引物：5’-GGGTTGTCTGCGAAAGCGAA-3’反向引物：5’-GTCTTCGTGCTGCGAGTTTG-3’TaqDNA聚合酶dNTPMix10×PCRBufferDNA提取试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒分子级琼脂糖DNAMarker：2000bp核酸染料：Gelred或Gelgreen5×TBE电泳缓冲液6×LoadingBuffer（上样缓冲液）阪崎肠杆菌质控菌株：ATCC29544或等效菌株QUESTIONTWO核酸提取过程中需要注意哪些方面？样本处理1、增菌：无菌称取奶粉式样100g，加到已预热的（45℃）装有900mLMLST的2L三角瓶中，振摇使样品充分混匀后，44℃恒温培养22h~24h。在页面1cm以下取MLST增军爷0.2mL加到装有5mLBHI的小试管中，混匀，36℃±1℃恒温水浴4h，水面要高于试管中培养高度。2、模板DNA提取：取BHI增菌液1.5mL，以10000r/min的转速离心2min，轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。按细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明书提取模板DNA，所提取的模板DNA溶于50µLTEbuffer中。如何选择正确的核酸提取试剂盒全血基因组DNA提取试剂盒组织/细胞基因组DNA提取试剂盒植物基因组DNA提取试剂盒真菌基因组DNA提取...
