实验前应明确的问题 1. 选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96 孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105 个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT 试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证 MTT 结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。 2. 药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。 3. 时间点的设定。在不同时间点的测定 OD 值，输入excel 表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么 时候 变得平 坦 了 （ 到了 平 台 期 ） 那 个时间点应该就 是最好 的时间点（ 因为 这个时候 的细胞增殖 抑制表现 的最明显 ） 。 4. 培养时间。200ul 的培养液 对 于10 的4~5 次 方 的增殖 期 细胞来 说 ，很难 维 持 68h，如 果营 养不够 的话 ，细胞会 由增殖 期 渐 渐 趋 向 G0 期 而 趋 于静 止，影 响 结果，我 们 是在48h 换 液的。 5. MTT 法 只 能测定细胞相 对 数和相 对 活 力 ，不能测定细胞绝 对 数。做 MTT 时，尽 量无 菌操 作 ，因为 细菌 也 可以导 致 MTT 比色 OD 值的升 高 。 6. 理 论 未 必 都 是对 的。要根据自己的实际 情况调 整 。 7. 实验时应设置 调 零 孔，对 照 孔，加 药孔。调 零 孔加 培养基 、MTT、二 甲 基 亚 砜 。对 照 孔和加 药孔都 要加 细胞、培养液 、MTT、二 甲 基 亚 砜 ，不同的是对 照 孔加 溶 解 药物的介 质 ，而 加 药组 加 入不同浓度的药物。 8. 避 免 血 清 干 扰 。用含 15%胎 牛 血 清 培养液 培养细胞时，高 的血 清 物质 会 影 响 试验孔的光吸 收 值。由于试验本底 增加 ，会 试验敏感性。因此，一般选小于10%胎 牛 血 清 的培养液 进行。在呈色 后，尽 量吸 净 培养孔内残 余 培养液 。 实验步 骤 贴壁细胞： 1. 收 集 对 数期 细胞，调 整 细胞悬 液 浓度，每孔加 入100ul，铺 板使 待 测细胞调 密 度至 1000-10...
